新型全淀粉样蛋白反应性抗体-肽融合蛋白AT-02（zamubafusp alfa）的研发及其在系统性淀粉样变性治疗中的应用

《npj Drug Discovery》：The antibody-peptide fusion protein, AT-02, is an effective opsonin with pan-amyloid reactivity

本研究针对系统性淀粉样变性治疗中器官功能障碍的临床难题，开发了具有全淀粉样蛋白反应性的免疫球蛋白-肽融合蛋白AT-02（zamubafusp alfa）。该融合蛋白通过特异性结合淀粉样纤维和高度硫酸化硫酸乙酰肝素（HS）糖链，实现了对AL、ATTR和ALECT2等多种淀粉样沉积的有效调理作用，显著增强巨噬细胞介导的吞噬作用并诱导补体固定。研究证实AT-02能促进组织淀粉样蛋白清除，为系统性淀粉样变性的治疗提供了新型广谱治疗策略。

　　

淀粉样蛋白在器官中的异常沉积是系统性淀粉样变性的核心病理特征，可导致心脏、肾脏等重要器官功能障碍甚至死亡。目前已知有20种不同蛋白质可形成系统性淀粉样纤维，其中野生型或变异型转甲状腺素蛋白（ATTRwt/ATTRv）和单克隆免疫球蛋白轻链（AL）是最常见的类型。尽管已有疗法能减缓淀粉样蛋白前体的产生，但直接清除组织淀粉样沉积仍是重大临床挑战。传统抗体疗法需针对不同淀粉样蛋白类型开发个体化抗体，这极大限制了治疗应用的广度。

美国田纳西大学健康科学中心（University of Tennessee Health Science Center）的研究团队基于前期发现的淀粉样蛋白结合肽p5R，开发了新型人源化IgG1k-肽融合蛋白AT-02（zamubafusp alfa）。该分子通过融合的p5R肽段可同时靶向淀粉样纤维和高度硫酸化的硫酸乙酰肝素（HS）糖链这两个淀粉样沉积的普遍组分，实现了对多种淀粉样蛋白类型的广谱识别能力。研究证实AT-02能有效调理淀粉样蛋白，增强巨噬细胞吞噬作用并诱导补体固定，在动物模型中显示出持久的淀粉样蛋白结合特性和清除效果。相关成果发表在《npj Drug Discovery》杂志。

研究采用的关键技术包括：表面等离子共振（SPR）分析AT-02与淀粉样纤维和肝素的结合动力学；糖阵列分析鉴定AT-02与不同糖胺聚糖的特异性结合；体外吞噬实验评估THP-1巨噬细胞对AT-02调理的淀粉样蛋白的摄取能力；补体固定实验检测C5b9复合物形成；放射性标记和光学成像技术追踪AT-02在AA淀粉样变性小鼠模型和人AL淀粉样蛋白移植瘤模型中的分布与清除效果。研究使用了来自患者的AL、ATTR和ALECT2淀粉样蛋白提取物作为实验材料。

AT-02（zamubafusp alfa）是人源化免疫球蛋白-肽融合蛋白

通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱证实，AT-02的轻链因融合肽p5R而分子量增加约3530 Da，分子流体力学半径相应增大。质谱分析显示部分还原的轻链-肽融合物分子量为27,572.5 Da，与理论值27,574.9 Da高度吻合。

AT-02结合带电糖胺聚糖和淀粉样纤维

AT-02对肝素的结合EC₅₀为12.5 nM，对合成rVλ6WIL纤维的EC₅₀达0.16 nM，显著优于对照抗体VH9/VL4（EC₅₀=74.5 nM）。SPR分析显示AT-02与rVλ6WIL纤维存在高亲和力（K_D=3.7 nM）和低亲和力（K_D=406 nM）两种结合模式。盐浓度实验证实静电相互作用介导结合，NaCl浓度从130 mM升至350 mM时，结合活性IC₅₀为215 mM（纤维）和187 mM（肝素）。

AT-02不结合游离免疫球蛋白轻链或非纤维状转甲状腺素蛋白

在竞争实验中，50 nM至50 μM浓度范围内的人Igκ/λ轻链、TTR四聚体和可溶性TTRv聚集体均不抑制AT-02与rVλ6WIL纤维的结合。捕获ELISA显示AT-02仅在500 nM高浓度时对TTR物种有微弱结合，而特异性抗TTR IgG在100 nM时即有显著结合。但当TTRv聚集体直接包被时，AT-02表现出明显结合（EC₅₀=31.6 nM），提示表面吸附可能暴露淀粉样特异性新表位。

与高电荷硫酸乙酰肝素的反应性

糖阵列分析显示AT-02选择性结合肝素和HS家族成员，结合强度与糖链负电荷量正相关（r_P=0.76）。在特异性HS阵列中，含6S和NS或3S和NS硫酸化的HS糖链结合最强。AT-02的结合模式与淀粉样成像肽p5+14高度相似（r_P=0.97），后者已用于临床PET/CT成像。

AT-02结合多种人类淀粉样蛋白类型

免疫组化证实AT-02特异性结合心脏ALκ、ALλ和ATTRv淀粉样沉积，以及肾脏ALECT2和脾脏ALECT2淀粉样沉积，不与无淀粉样蛋白的组织反应。ELISA显示AT-02对多种人类淀粉样提取物具有亚纳摩尔级结合力：ATTRv（EC₅₀=0.45 nM）、ATTRwt（0.18 nM）、ALκ（0.60 nM）和ALλ（0.32-0.36 nM）。

AT-02通过FcγR介导的相互作用增强AL和ATTR淀粉样蛋白的吞噬作用并固定补体

AT-02剂量依赖性地增强PMA激活的THP-1巨噬细胞对人类AL和ATTR淀粉样提取物的吞噬，半数最大浓度分别为ALκ（7.7 nM）和ATTRwt（5.2 nM）。流式细胞术显示10 nM AT-02即可使50%的THP-1单核细胞摄取胶原基质上的ATTRwt淀粉样蛋白。FcR阻断剂和热聚集IgG可抑制吞噬作用。在人类血浆存在下，AT-02显著促进rVλ6WIL纤维和ATTRwt心脏提取物上C5b9复合物的形成。

AT-02的药代动力学和血清稳定性

在无淀粉样蛋白的野生型小鼠中，¹²⁵I-AT-02和未标记AT-02的药代动力学相似，终末半衰期约24小时。AT-02在人血清中37°C孵育9天后活性仅降低28%，而在小鼠血清中24小时内即迅速失活。

AT-02在小鼠严重系统性淀粉样变性中特异性结合并持续保留

在AA淀粉样变性小鼠模型中，¹²⁵I-AT-02在肝、脾和胃中的蓄积显著高于¹²⁵I-hIgG1对照（p<0.0001）。小动物SPECT/CT成像显示注射后4小时和24小时在肝脏和脾脏有明显的AT-02摄取。显微放射自显影证实AT-02特异性定位于肝窦、脾脏滤泡周围和心脏淀粉样沉积，且结合可持续至少7天。

AT-02快速结合小鼠体内人类AL提取物并增强体内吞噬作用和淀粉样蛋白清除

在NU/NU小鼠人类AL淀粉样瘤模型中，Dylight800标记的AT-02无论静脉或腹腔注射均在1天内迅速定位于淀粉样瘤，荧光信号持续至第10天。预处理AT-02的pHrodo Red标记AL淀粉样蛋白在体内吞噬作用显著增强（p=0.0058）。组织学显示AT-02治疗组淀粉样瘤中巨噬细胞浸润明显增加，可见巨噬细胞内嗜酸性淀粉样物质。

这项研究开发的AT-02（zamubafusp alfa）代表了淀粉样变性治疗领域的重要突破。其创新性在于通过融合肽策略实现了对多种淀粉样蛋白类型的广谱识别能力，克服了传统抗体疗法需要针对不同淀粉样蛋白开发个体化抗体的局限性。研究证实AT-02能有效调理淀粉样沉积，通过FcγR介导的吞噬作用和补体固定促进淀粉样蛋白清除，这为改善器官功能提供了新机制。特别值得注意的是，AT-02对包括AL、ATTR和ALECT2在内的多种淀粉样蛋白均表现出高度亲和力，使其具有治疗罕见淀粉样变性类型的潜力。临床前数据支持AT-02目前正在进行的临床评估（NCT05951049