基于Nextclade平台的禽流感A(H5)病毒数据集开发：实现快速精准分支鉴定的新工具

本研究针对高致病性禽流感A(H5)病毒分支鉴定工具匮乏的问题，开发了基于Nextclade平台的三种数据集（全分支/2.3.2.1/2.3.4.4分支），通过树状突变比对方法实现97%以上的分支匹配率，可自动识别多碱基切割位点和N-糖基化位点，为公共卫生监测提供无需命令行操作的浏览器界面解决方案。

　　

禽流感病毒A(H5)的持续进化对全球公共卫生构成严峻挑战。自1996年中国广东鹅源H5N1病毒(GsGd)出现以来，高致病性禽流感(HPAI)病毒通过HA基因突变和重配形成了复杂的进化分支系统。当前2.3.4.4b分支病毒引发的泛动物流行病已波及哺乳动物，而北美和欧洲野生鸟类中低致病性禽流感(LPAI)的地方性流行更增加了监测复杂性。传统分支鉴定工具如LABEL依赖命令行操作，且无法同时分析糖基化位点等关键特征，严重制约了公共卫生应急响应能力。

宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院微生物系Jordan T.Ort团队联合美国疾控中心等机构，在《Virus Evolution》发表研究，开发了基于Nextclade平台的禽流感A(H5)HA基因分析系统。研究采用WHO/FAO/WOAH工作组提供的407株历史毒株、2,422株2.3.2.1分支和10,079株2.3.4.4分支参考序列，补充18株LPAI毒株构建三大数据集。通过MAFFT比对和IQ-TREE 2构建系统发育树，利用Augur clades确定分支定义突变，实现浏览器拖拽式操作的分支鉴定、质量控制和功能位点分析。

关键技术包括：1) 基于GISAID和FluDB的19,834株验证序列进行性能评估；2) 采用TreeTime进行祖先状态重建；3) 建立私有突变阈值（全分支数据集97.5百分位数为97个突变）；4) 与LABEL v0.6.5进行平行比对验证。

研究结果：

1. 数据集构建

   开发的全分支数据集包含432株参考序列，以A/Goose/Guangdong/1/1996为参考株；2.3.2.1和2.3.4.4专用数据集分别包含1,654和1,900株序列，采用疫苗候选株A/duck/Vietnam/NCVD-1584/2012和A/Astrakhan/3212/2020作为参考。系统自动识别HA_1-533的N-X-S/T糖基化位点和341-346位多碱基切割位点（含4个以上精氨酸/赖氨酸标记为HPAI特征）。

2. 性能验证

   全分支数据集对19,833株独立测试序列的匹配率达94.8%，2.3.2.1和2.3.4.4数据集分别达97.8%和99.1%。值得注意的是，2.3.4.4f分支与2.3.4.4-like的错配主要源于"like"分支的非单系性特征。运行时分析显示，Nextclade处理10,000条序列仅需20秒，效率较LABEL提升100倍。

3. 特殊功能

   系统可自动报告：① 相对于参考株的所有核苷酸突变和氨基酸替换；② 潜在糖基化位点；③ 移码突变等质量控制指标；④ 区分HPAI/LPAI的关键分子标记。

该研究建立的树状分类体系突破了传统隐马尔可夫模型的局限，首次实现禽流感病毒分支鉴定的可视化操作。其创新性体现在：1) 整合最新2.3.2.1d-g和2.3.4.4a-h分支分类；2) 通过祖先节点注释解决"like"分支的归类难题；3) 为监测实验室提供即时的分子特征分析能力。未来可通过定期更新参考数据集适应病毒持续进化，并扩展至H7/H9等其他禽流感亚型分析。这项技术将显著提升对H5Nx跨种传播风险的早期预警能力，为全球禽流感防控提供重要技术支撑。