昆虫细胞糖基化工程改造线虫抗原：一种生产捻转血矛线虫生物活性疫苗抗原的新策略

本研究针对捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)疫苗抗原H11因糖基化异常导致重组表达失效的难题，通过创新性地将秀丽隐杆线虫(C. elegans)的糖基修饰基因(aman-3/fut-6/galt-1)导入Hi5昆虫细胞，成功构建了能合成三岩藻糖基化核心结构(Galβ1,4Fuc)的工程化表达系统。该研究首次实现具有线虫特异性糖链的重组H11和GA1抗原生产，证实其保留氨基肽酶活性并能刺激羊外周血单核细胞(PBMCs)分泌IL-1β等细胞因子，为开发新一代抗寄生虫疫苗提供了关键技术平台。

　　

在畜牧业中，被称为"理发师杆虫"的捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)每年造成数十亿美元的经济损失。这种吸血性寄生虫通过破坏反刍动物的消化道黏膜导致贫血甚至死亡，当前主要依赖苯并咪唑类驱虫药控制。然而随着全球范围内耐药虫株的涌现，以及药物残留对环境和食品安全的威胁，开发高效疫苗成为迫切需求。

奥地利维也纳兽医大学(University of Veterinary Medicine Vienna)的研究团队发现，从成虫肠道微绒毛提取的天然H11氨基肽酶能诱导绵羊产生强保护性免疫，但其重组形式在细菌、昆虫细胞甚至转基因线虫中的表达均告失败。深入分析表明，天然H11携带独特的N-糖链修饰——核心三岩藻糖基化结构和Galβ1,4Fuc表位，这些在常规表达系统中无法复制的糖基化特征可能是构象表位的关键组成部分。

为解决这一难题，研究人员开创性地采用糖基化工程策略：首先通过生物信息学鉴定出H. contortus KB株的7种H11同源异构体，随后将C. elegans的三种糖基转移酶基因(高尔基体甘露糖苷酶III AMAN-3、核心α1,3-岩藻糖转移酶FUT-6和β1,4-半乳糖转移酶GALT-1)导入Hi5昆虫细胞，构建出能合成线虫型糖链的工程化表达系统。通过多组学分析和功能验证，系统评估了重组抗原的生物学活性和免疫原性。

关键技术方法包括：1) 基于AlphaFold预测的H11保守表位设计多克隆抗体；2) 采用MultiBac?系统构建含糖基化模块的重组杆状病毒；3) Hi5细胞悬浮培养与亲和层析纯化；4) MALDI-TOF MS/MS解析N-糖链结构；5) 羊PBMCs体外刺激实验结合Luminex多重细胞因子检测。

H11抗原的表达特征与分子进化

通过比较基因组学在H. contortus染色体5上定位7个h11基因位点，系统发育分析将其分为H11、H11-1、H11-2、H11-4和H11-5五个主要分支。定制抗体证实H11蛋白呈现发育阶段特异性表达，仅在成虫肠道检测到，这与该寄生虫吸血取食的生物学特性相符。

糖基化工程抗原的制备与表征

工程化设计的重组抗原去除了跨膜结构域，引入蜂毒肽信号肽和HisFLAG双标签。糖基化改造组(geH11)产量达9 mg/L，非改造组(H11-1)最高达71 mg/L。质谱分析显示，改造组成功合成含Galβ1,4Fuc的三岩藻糖基化结构(H₃N₂F₃，m/z 1427)，而对照组仅含双岩藻糖基化糖链。

抗原的生物学功能验证

所有重组H11在pH5-8范围内均保持氨基肽酶活性。体外实验显示，含Quil A?佐剂的糖基化抗原(geH11+)能显著诱导羊PBMCs分泌IL-1β、MIP-1α/β等细胞因子，其反应强度超过商业疫苗Barbervax?。值得注意的是，改造组引发的IL-10持续分泌模式提示可能形成更平衡的免疫调节。

这项研究的意义在于：1) 首次实现具有线虫特异性糖链的重组抗原规模化生产，解决了三十年来H11重组表达失效的难题；2) 证实糖基化修饰对维持构象表位和免疫原性的关键作用，为其他寄生虫疫苗开发提供范式；3) 建立的Hi5细胞工程平台可扩展应用于血吸虫等病原体疫苗研发。后续动物试验证实，糖基化疫苗使虫荷减少25.36%，粪便虫卵排出量降低81.09%，显著优于非糖基化版本。该成果不仅为抗寄生虫疫苗开辟新途径，其糖基化工程技术对糖蛋白药物开发也具有广泛借鉴价值。