CRISPR-Cas9介导的严格裂解性广宿主葡萄球菌噬菌体K的高效基因组编辑

本研究创新性地利用CRISPR-Cas9辅助同源重组技术，成功构建了携带纳米荧光素酶（nluc）报告基因的Twortvirinae亚科噬菌体K工程株（K::nluc），为耐药金黄色葡萄球菌（S. aureus）的快速检测提供了高灵敏度生物发光工具，并在全血和生牛乳等复杂基质中验证了其诊断潜力，为噬菌体疗法和精准诊断开辟了新路径。

CRISPR-Cas9辅助的葡萄球菌报告噬菌体K构建

面对金黄色葡萄球菌（S. aureus）日益严重的耐药性问题，研究者选择Twortvirinae亚科的模式噬菌体K作为工程支架。这种严格裂解性噬菌体具有148 kb的大基因组和广宿主特性，但传统方法难以编辑。通过设计携带纳米荧光素酶（nluc）的同源重组质粒pEDIT_nluc，结合靶向主要衣壳蛋白（cps）基因的CRISPR-Cas9反选择系统pSELECT_CPS，成功实现了在RN4220宿主菌中的高效重组。关键创新点在于：通过同义突变破坏原间隔区相邻基序（PAM），使重组噬菌体逃逸Cas9切割，最终获得携带516 bp报告基因的K::nluc工程株。

跨耐药菌株的感染特性与生物发光动力学

定量分析显示，K::nluc噬菌斑面积虽较野生型减小0.06985 mm²，但保留了广谱感染能力。在71株临床分离株（包括万古霉素敏感株VSSA、中介株VISA和耐药株VRSA）的测试中，尽管20株未形成可见噬菌斑，但所有菌株均能产生超过背景10⁶倍的相对光单位（RLU）。特别值得注意的是，在OD₆₀₀=0.01的菌液浓度下，3小时内即可达到信号峰值，对PSK、LI6和VRSA7的检测限分别为1,093、2,617和707 CFU/mL，展现了优异的灵敏度。

复杂基质中的诊断应用突破

针对临床常见的血流感染和牛乳腺炎场景，研究团队优化了全血和生牛乳中的检测方案。采用5倍稀释+1小时预孵育策略后，在含柠檬酸盐抗凝剂的人全血中，PSK、LI6和VRSA7的检测限分别达2,151、136和1,270 CFU/mL；而在生牛乳中更提升至55-514 CFU/mL。这一性能突破了过去认为乳清蛋白会抑制噬菌体吸附的理论预期，为现场快速检测提供了新可能。

工程平台的潜在拓展价值

该研究建立的CRISPR-Cas9辅助平台具有多重应用前景：

1. 诊断方面：可开发针对其他病原体的报告噬菌体阵列，或用于抗生素敏感性测试（AST）

2. 治疗方面：通过递送抗菌效应蛋白（如内溶素）靶向清除耐药菌

3. 机制研究：探索噬菌体与休眠细菌（如持留菌）的相互作用

现存挑战与未来方向

当前技术仍受限于宿主转化效率，需依赖限制缺陷型RN4220菌株。未来可通过构建人工修饰系统或开发新型递送载体突破这一瓶颈。此外，噬菌体对表皮葡萄球菌（S. epidermidis）等近缘种的交叉反应性，提示需要开发特异性标记物以提高诊断准确性。

这项研究不仅为Twortvirinae亚科噬菌体的工程化提供了标准化流程，其构建的K::nluc更成为连接基础研究与临床应用的桥梁，为应对抗生素耐药危机提供了创新解决方案。