吸入式工程化小细胞外囊泡递送CAR mRNA实现肺癌转移与复发的原位CAR巨噬细胞治疗

本研究针对肺癌转移和复发这一临床难题，创新性地开发了靶向CD206的工程化小细胞外囊泡(CARmRNA@aCD206 sEVs)，通过吸入给药实现肺组织特异性递送，将嵌合抗原受体(CAR)mRNA递送至M2型巨噬细胞并原位生成CAR-Ms。该策略突破了传统CAR-M疗法体外制备复杂、肝靶向性强的局限，在肺癌转移模型中显著抑制肿瘤生长并诱导长期免疫记忆，为实体瘤免疫治疗提供了新范式。

　　

肺癌转移和复发是癌症治疗失败的主要原因，其中肺部作为最常见的转移靶器官，传统疗法效果有限。尽管嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法在血液肿瘤中取得突破，但其在实体瘤应用中面临肿瘤浸润不足和毒副作用等挑战。相比之下，巨噬细胞具有天然肿瘤趋向性和抗原呈递能力，CAR修饰的巨噬细胞(CAR-M)展现出治疗潜力。然而现有CAR-M技术依赖复杂的体外制备流程，且静脉注射后主要滞留于肝脏，难以有效靶向肺转移灶。

中山大学附属第五医院的研究团队在《Nature Communications》发表创新成果，开发了可吸入的工程化小细胞外囊泡(CARmRNA@aCD206 sEVs)，通过靶向递送CAR mRNA至肺组织M2型巨噬细胞，实现原位CAR-M生成。该技术巧妙结合了sEV的天然递送优势与吸入给药的局部靶向性，突破了传统细胞疗法的制备瓶颈。

关键技术包括：(1)构建CD206靶向的sEV递送系统，通过L7Ae-C/D box相互作用高效装载CAR mRNA；(2)建立B16-MSLN小鼠肺癌转移模型；(3)采用流式细胞术和活体成像评估CAR-M生成效率及抗肿瘤效果；(4)通过Transwell实验分析CAR-M对T细胞和树突细胞的免疫调节作用。

CARmRNA@aCD206 sEVs的制备与特性

研究团队设计了包含CD63-L7Ae-P2A-Cx43 S368A融合蛋白、抗MSLN CAR-C/D box mRNA和抗CD206-LAMP2的复合系统。透射电镜显示sEVs呈典型椭圆形，粒径约124nm。Western blot证实sEVs成功表达CD206-scFv和L7Ae蛋白，每个sEV携带约693拷贝CAR mRNA。共聚焦显微镜证实72%的LAMP2与CD63共定位，确保单个sEV同时携带靶向模块和功能载荷。

体外CAR-M生成与功能验证

DiI标记实验显示CARmRNA@aCD206 sEVs可特异性内化至M2型骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，内化效率较非靶向sEV提高3倍。流式检测证实73%的BMDM表达CAR蛋白，且呈剂量依赖性。生成的CAR-M对MSLN⁺肿瘤细胞吞噬能力增强2.5倍，细胞毒性在E:T=10:1时达85%，并显著提升IFN-γ和TNF-α分泌，同时抑制IL-10产生。

肿瘤微环境重编程

CARmRNA@aCD206 sEVs将M2型巨噬细胞复极为M1样表型，CD86和MHC II表达上调而CD206下调。Western blot显示AKT、NF-κB p65和ERK通路激活。Transwell实验证实CAR-M促进T细胞增殖和树突细胞成熟，显著增加肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润，同时降低Treg和MDSC比例。

体内治疗效果评估

吸入给药后sEVs在肺组织滞留达48小时，而静脉注射主要分布于肝脏。在B16-MSLN肺癌转移模型中，治疗组小鼠生存期超过60天(对照组<30天)，肺结节减少80%。免疫荧光显示28%的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和21%的肺泡巨噬细胞(AM)表达CAR蛋白。

长期免疫记忆诱导

治愈小鼠对B16-MSLN再攻击完全抵抗，淋巴结中T_CM和T_EM细胞增加3倍。值得注意的是，该保护作用延伸至MSLN^-肿瘤，表明存在表位扩散效应。

该研究开创性地将吸入给药、sEV递送和原位细胞重编程技术整合，建立了无需体外操作的CAR-M治疗平台。其双靶向设计(CD206靶向+MSLN CAR)不仅解决递送特异性问题，还通过表位扩散克服抗原逃逸。临床转化潜力显著：sEVs可冻存运输，剂量易标准化，且吸入给药规避全身毒性。这项技术为肺癌转移及其他实体瘤的免疫治疗开辟了新途径。