油菜籽蛋白连续色谱纯化技术的创新突破：同时高效分离napin与cruciferin的可持续工艺开发

本文创新性地开发了一种连续色谱纯化平台，通过阳离子交换（CEX）和阴离子交换（AEX）色谱技术同步分离油菜籽中的主要储存蛋白napin（pI 10-11）与cruciferin（pI 7.2）。该工艺通过参数优化实现直接耦合操作，显著减少缓冲液消耗（减少30%处理时间），获得高纯度（>95%）蛋白产物，为植物源生物聚合物在药物递送系统（如纳米载体）和功能食品中的应用提供了可持续解决方案。

　　

油菜籽蛋白纯化的技术挑战

作为全球第二大油料作物，油菜（Brassica napus L.）籽粕含有50%的优质蛋白，其中cruciferin（11S球蛋白）占60%，napin（2S白蛋白）占30%。这两种蛋白具有优异的乳化性和凝胶特性，被美国FDA列为GRAS物质，在药物封装和递送领域展现出巨大潜力。然而传统碱提酸沉法会导致蛋白聚集失活，亟需开发可规模化的高效纯化工艺。

色谱工艺的智能设计

研究团队通过系统筛选，确定Eshmuno CPX（CEX）和Eshmuno Q（AEX）分别作为napin和cruciferin的最佳纯化介质。关键发现包括：

• 动态结合容量（DBC）优化：在pH 7.5条件下，napin的DBC_10%达78 mg/mL_CV；cruciferin在pH 9.5时DBC_10%达141 mg/mL_CV

• 竞争性结合现象：cruciferin在CEX中会与napin竞争结合位点，即使pH高于其等电点（pI 7.2）仍能保留28 mg结合量

• 多柱串联效应：双柱串联使napin处理量提升100%，cruciferin处理量提升76%

连续纯化工艺突破

创新性地建立了"先AEX后CEX"的连续流程：

1. 第一级AEX纯化cruciferin：采用pH 9.5的Tris缓冲体系，四柱循环系统实现20.65 mg/mL_CV/h产率

2. 流穿液pH调节至7.5后进入CEX：三柱系统捕获napin，产率17.24 mg/mL_CV/h

3. 关键控制点：柱切换体积优化为70mL（AEX）和100mL（CEX）

技术优势与验证

• 纯度保障：SDS-PAGE证实最终产物仅含目标蛋白亚基（cruciferin的α/β链和napin多肽）

• 过程强化：较传统批次工艺减少35%缓冲液用量

• 稳定性验证：cruciferin纳米颗粒在胃肠条件下保持稳定

应用前景与可持续价值

该技术为油菜籽粕高值化利用开辟新途径：

• 药物递送：cruciferin纳米载体（300 kDa）可保护生物活性成分

• 功能食品：napin（14.5 kDa）的乳化性能优于合成乳化剂

• 循环经济：每年可转化8500万吨油粕副产品

工艺优化方向

未来研究可聚焦：

1. 增加串联柱数（>4柱）提升通量

2. 探究napin-cruciferin复合物解离机制

3. 开发在线监测控制系统

这项研究首次实现了植物储存蛋白的双连续色谱纯化，通过精准控制pH和离子强度参数，为生物基材料的规模化生产提供了创新范式。