氢氘交换质谱技术解析分子胶稳定蛋白互作机制及构象动态变化

这篇综述创新性地将氢氘交换质谱（HDX-MS）技术应用于分子胶（MG）作用机制研究，通过14-3-3σ/ERα/FC-A（fusicoccin A）模型系统，揭示了分子胶不仅可精确定位结合位点，更能捕捉蛋白-蛋白相互作用（PPI）稳定化过程中的构象重排与动态变化，为分子胶药物的理性设计提供了全新分析维度。

　　

Abstract

分子胶作为稳定蛋白互作（PPI）的生物活性分子，其精确作用机制尚不明确。传统原生质谱（native MS）虽能监测分子胶诱导的三元复合物形成，但难以解析动态构象变化。本研究通过氢氘交换质谱（HDX-MS）技术，以真核调控蛋白14-3-3及其配体ERα（雌激素受体α）和分子胶FC-A为模型，首次实现分子胶结合位点与构象变化的同步解析。结果显示，FC-A通过结合14-3-3的H3-H5区域增强ERα亲和力，并诱导H4-H8二聚界面的动态抑制，而LRRK2（富含亮氨酸重复激酶2）系统因结合模式差异未表现类似稳定效应。

1 Introduction

蛋白互作（PPI）调控细胞信号、代谢等核心生命过程，其异常与多种疾病相关。分子胶（MG）通过界面互补结合稳定二元复合物，较双功能分子（如PROTACs）更具选择性优势，但其发现多依赖偶然筛选。现有表征技术如X射线晶体学仅提供静态结构，而HDX-MS能动态监测溶剂可及性变化，此前已用于PROTACs研究。14-3-3作为二聚体枢纽蛋白，其"模式3"结合伙伴（如ERα_581-595pT594）可与FC-A形成稳定三元复合物，成为理想模型。

2 Results and Discussion

PPI基础表征：HDX-MS分析显示，ERα结合14-3-3σ后，其结合沟槽（H3/H7/H9）氘代保护率达24%，远端H8区域亦出现保护，提示变构效应。LRRK2_928-942pS935结合时保护程度较低，与较低亲和力一致。

分子胶效应：FC-A使14-3-3σ/ERα复合物的H3-H5区域新增保护（Δ%Deut=8-15%），对应FC-A结合口袋；H4-H8二聚界面保护增强，表明分子胶通过限制蛋白柔性强化复合物稳定性。而14-3-3/LRRK2系统中仅微弱保护（~8%），印证FC-A对"模式3"的特异性。值得注意的是，无序C端（232-248）在所有条件下均显示高氘代率，提示其动态特性不受分子胶影响。

技术优势：HDX-MS成功捕获晶体学无法解析的柔性区域信息，如14-3-3 C端构象动态。时间尺度优化（10 min-24 h）有效区分直接结合与变构效应，为K_d在μM级的可溶性寡聚体（≤60 kDa）提供普适分析方案。

3 Conclusion

HDX-MS可同步解析分子胶的结合位点、PPI界面及构象变化，其分钟级动态监测能力弥补了晶体学局限。本研究证实FC-A通过双重机制（直接结合+变构稳定）增强14-3-3/ERα互作，为分子胶优化提供了动态结构基础。该方法适用于中等亲和力（100-1000 μM）的各类三元复合物系统，将成为分子胶药物开发的关键技术。

4 Experimental Section

样品制备：His₆-14-3-3σ经Ni²⁺亲和层析纯化，与ERα/LRRK2肽段及FC-A孵育（摩尔比1:1:10）。

HDX流程：氘代反应（pD 7.2）在10 min/5 h/24 h终止，双蛋白酶（nepenthesin-2/pepsin）在线消化，LC-MS检测。最大氘代对照（50°C过夜）用于计算29.6%背交换率。

质谱参数：Orbitrap Eclipse（分辨率60,000），正离子模式（3.5 kV），数据经HDExaminer分析（p≤0.05判定显著性）。

创新设计：采用双蛋白酶柱使肽段覆盖率提升至96%，较传统pepsin柱（≤88%）显著优化；冰浴色谱系统（0-4°C）有效控制氢回交换。