厌氧氨氧化菌Kuenenia stuttgartiensis中一氧化氮形成亚硝酸盐还原酶的多样性及其生理意义

这篇研究揭示了厌氧氨氧化菌（anammox）Kuenenia stuttgartiensis通过两种可溶性亚硝酸盐还原酶（NirS和HAOr）维持一氧化氮（NO）池的分子机制。研究结合快速蛋白液相色谱（FPLC）富集技术和膜进样质谱（MIMS）活性分析，证实NirS和HAOr在体外均能高效催化亚硝酸盐还原为NO，其冗余性可能增强菌株对环境亚硝酸盐浓度波动的适应性，为理解anammox细菌的氮循环策略提供了新视角。

　　

可溶性亚硝酸盐还原酶主导Kuenenia stuttgartiensis的一氧化氮生成

研究首先通过细胞分级实验发现，99%的亚硝酸盐还原活性存在于可溶性蛋白组分中，膜蛋白仅贡献7%且活性在4分钟后停止。使用膜进样质谱（MIMS）监测¹⁵N-亚硝酸盐转化为¹⁵NO的过程，测得可溶性蛋白的比活性达12 nmol·min^-1·mg^-1，较粗提物富集2倍。这一结果明确否定了膜结合蛋白Kuste4574作为主要催化酶的假说。

低分辨率层析锁定活性峰

采用低分辨率阴离子交换层析（Q-Sepharose）分离可溶性蛋白，发现65%的活性集中于峰B（9-17组分），其中亚组分B1（11-14组分）比活性达18 nmol·min^-1·mg^-1。非结合组分（FT）虽仅占5.3%总活性，但比活性高达14 nmol·min^-1·mg^-1，提示存在另一种高效还原酶。

高分辨率层析与蛋白质组学联用鉴定NirS

对活性峰B1进行高分辨率Source 15Q柱分离后，第9组分比活性飙升至336 nmol·min^-1·mg^-1（富集29倍）。蛋白质组学显示细胞色素cd₁型亚硝酸盐还原酶NirS（kuste4136）的相对丰度与活性高度正相关（Pearson r=0.87），其表达量虽低于其他anammox核心酶，但高比活性可能弥补了低丰度缺陷。

羟基胺氧化还原酶HAOr的意外高活性

通过羟基磷灰石混合模式层析分离FT组分，发现UV峰4的比活性达62.5 nmol·min^-1·mg^-1，较既往纯化HAOr的报道活性高125倍。蛋白质组学证实HAOr（kustc0458）丰度与活性显著相关（r=0.99），其与电子传递伙伴kustc0457可能形成高效还原系统。

双酶系统的生理意义与未解之谜

NirS和HAOr的共存可能赋予K. stuttgartiensis应对环境波动的双重优势：NirS的高催化速率（接近反硝化菌的1/12）适合高亚硝酸盐条件，而HAOr的广泛保守性可能保障基础NO供应。值得注意的是，两种酶在亚硝酸盐限制条件下均显著上调（NirS上调10倍，HAOr 2.5倍），但具体调控机制仍待解析。免疫金定位显示HAOr靠近anammoxosome膜，而NirS的亚细胞定位尚未明确，这为后续研究酶的空间组织与电子传递链偶联提供了方向。

研究同时讨论了近期争议：尽管有团队提出羟基胺脱氢酶（HOX）可能参与还原，但本数据表明其在活性峰中的相关性（r=0.60）显著低于NirS（r=0.87）。这种功能冗余现象与某些反硝化菌同时携带NirS/NirK的案例类似，但anammox菌中双还原酶的进化驱动力仍需从能量守恒（如anammoxosome膜电位耦合）角度深入探索。