铜绿假单胞菌KT2440中TonB依赖转运系统在生物电化学体系中促进无机金属介体摄取的作用机制研究

这篇综述揭示了铜绿假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440通过TonB依赖转运系统(TBDRs)主动摄取铁氰化物([Fe(CN)6]3?/4?)等人工介体的分子机制。研究结合转录组学和功能实验证实，TBDRs在介体转运中起主导作用，而外膜孔蛋白OprF过表达可协同增强膜通透性和电流输出，为优化生物电化学系统(BES)的胞外电子传递(EET)效率提供了新策略。

　　

引言

严格需氧的铜绿假单胞菌KT2440在含亲水性氧化还原介体（如[Fe(CN)₆]^3?/4?和[Co(bipy)₃]^3+/2+）的生物电化学系统(BES)中可维持数周厌氧代谢。这种适应性依赖于介体基胞外电子传递(EET)，其效率受介体跨膜转运限制。虽然呼吸链复合体III（细胞色素c还原酶）被证实是介体相互作用的关键位点，但介体如何穿越外膜进入周质空间的机制尚不明确。

结果

外膜基因表达分析揭示TonB依赖受体的核心作用

转录组数据显示，在1 mM铁氰化物处理的BES中，30个TonB依赖受体(TBDRs)中有27个显著上调（log₂-FC≥2），其中PP_1446和PP_3325在蛋白质组水平也显著富集。同时，金属稳态相关基因（如czcC、copBI等）同步激活，提示细胞可能将铁氰化物识别为金属应激源或潜在营养源。

TonB复合体缺失导致生长缺陷与电子传递障碍

敲除tonB-exbBD基因簇的突变株在基础DM9培养基（5.5 μM FeCl₃）中生长速率降低7倍，补充20 μM FeCl₃可恢复80%生长能力。在厌氧血清瓶实验中，突变株的铁氰化物还原速率降至野生型的46%（0.026 vs 0.056 mM/h），BES中的峰值电流下降50%以上，且葡萄糖代谢偏向还原态产物葡萄糖酸积累（氧化度3.67 vs 2KG的3.33）。

双转运系统的功能互补性

虽然增加铁氰化物浓度（0.5→4.0 mM）或过表达普通孔蛋白OprF可使野生型菌株的介体还原速率提升3倍（至0.17 mM/h），但ΔtonB突变株中OprF过表达无法提升活性。NPN荧光探针实验证实OprF使膜通透性增加3.6倍，但仅当TonB系统完整时才能显著提升BES的初始电流（2.1 vs 0.5 mA）和电子传递速率（1.15 vs 1.035 mmol g_CDW^?1 h^?1），表明TBDRs主导介体摄取而OprF主要协助介体外排。

讨论

铜绿假单胞菌的TBDRs传统认知集中于铁载体转运，但本研究首次揭示其对人工金属介体的广谱识别能力。这种特性可能源于其基因组中10个与FecIR调控簇同源的TBDRs，以及多个ECF sigma因子（如PP_3086等）的协同调控。与自然介体（如绿脓菌素）的特异性转运不同，铁氰化物等小分子（<3 kDa）可能通过OprF被动扩散与TBDRs主动转运的双重途径实现高效周质递送。

结论

该研究阐明了TBDRs在人工介体转运中的核心地位，突破性地将TonB系统的功能范畴从天然铁载体拓展至合成金属配合物。通过工程化改造TBDRs表达谱与OprF通透性的协同作用，为构建高效BES生物催化剂提供了新思路，推动非模式电活性菌在生物制造中的应用。未来需结合靶向代谢工程（如强化葡萄糖脱氢酶Gcd途径）进一步优化电子传递链的整体效率。