牛鼻炎A病毒(BRAV)广谱检测常规逆转录PCR系统的开发与应用

这篇研究开发了一种针对牛鼻炎A病毒(BRAV)的新型常规逆转录PCR(RT-PCR)检测系统，通过靶向高度保守的3Dpol区域设计引物，实现了对BRAV1/2/3型的广谱检测。与现有两种实时RT-PCR系统相比，新系统灵敏度更高(检测限达10?2 TCID50/mL)，特异性良好(无BRDC相关病毒交叉反应)，临床样本检出率提升2.5-7.5倍(15/125阳性)，为牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的病原诊断提供了更可靠工具。

　　

ABSTRACT

牛鼻炎A病毒(BRAV)作为小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)成员，近年来被重新关注为牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的重要病原体。研究团队针对现有检测方法覆盖率不足的问题，开发了靶向3D^pol保守区的新型RT-PCR系统，通过系统验证展现了优异的诊断性能。

1 Introduction

BRAV自1962年首次分离以来，因其低致病性导致研究停滞数十年。新一代测序技术揭示其在BRDC病牛中的高携带率，但现有PCR方法仅基于有限基因组信息设计。作为易变异的RNA病毒，BRAV已分化出BRAV1/2/3型，且存在显著基因重组现象。本研究旨在建立覆盖所有已知亚型的检测体系，为BRDC防控提供关键技术支撑。

2 Materials and Methods

2.1 Viruses

选用H-1(BRAV2)和NSWL8(BRAV3)代表株，后者采用合成DNA(OP020173.1, 5960-6311位点)。对照病毒包括BHV1、BAdV7等8种BRDC相关病原及BRBV、FMDV等口蹄疫病毒属成员。

2.2 Clinical Samples

2019-2023年从日本埼玉县采集125份样本（97鼻拭子、6结膜拭子、22肺组织），来自46头奶牛和79头肉牛，经DMEM培养基处理后过滤除菌。

2.4 Primer Design

通过MEGA-11比对8株BRAV全基因组，在3D^pol区(6550-6801位)设计引物对6550-6570F/6782-6801R，产物252bp。引物在Sd-1株(NC_038303.1)的保守性达93%以上。

2.5 RT-PCR系统

采用SuperScript III一步法试剂，反应程序：55℃ 30min逆转录；94℃ 2min预变性；38个循环(94℃ 15s, 60℃ 30s, 68℃ 16s)；68℃ 5min终延伸。

3 Results

3.1 灵敏度

对H-1株的检测限达10^?2 TCID₅₀/mL，优于现有系统A(10⁰)；对NSWL8合成DNA检测限为10⁴ copies/μL。

3.2 特异性

与所有BRDC相关病毒(BHV1、BRSV等)及口蹄疫病毒属成员(BRBV、FMDV等)均无交叉反应。

3.3 临床检出

新系统检出15例阳性(12%)，显著高于现有系统A(2例)和B(6例)。测序证实扩增片段与BRAV1 USII/02株(KU159364.1)同源性达93.36%-96.20%。

4 Discussion

该研究突破性在于：

1. 首次实现BRAV1/2/3型同步检测

2. 采用常规RT-PCR克服实时PCR对保守区要求苛刻的限制

3. 检出率提升验证了日本流行株存在基因变异

   未来可基于本引物开发实时PCR，并与病毒分离技术联用，解决传统BK细胞培养法周期长、敏感性低的问题。

5 Conclusion

新型RT-PCR系统为BRAV研究提供了高灵敏度、广谱性的检测工具，将显著推动BRDC病原学研究和临床诊断水平的提升。