基于糖基化工程膜抗原模块(geGMMA)的多价肺炎克雷伯菌疫苗研发：从减毒策略到免疫保护

本文创新性构建了糖基化工程膜抗原模块(geGMMA)疫苗平台，通过基因改造大肠杆菌W3110 ΔwbbH-L ΔlpxM::lpxE实现肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)O1/O2血清型多糖抗原的高效表达，制备的OMV(外膜囊泡)疫苗在小鼠模型中展现出显著免疫原性和保护效果，为应对多重耐药菌感染提供了新型疫苗开发策略。

　　

ABSTRACT

多重耐药的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)作为重要院内感染病原体，目前尚无上市疫苗。研究采用基因工程改造的大肠杆菌W3110 ΔwbbH-L ΔlpxM::lpxE作为底盘细胞，通过消除内源多糖合成途径并引入肺炎克雷伯菌O1/O2血清型外源多糖生物合成通路，成功构建了基于糖基化工程膜抗原模块(geGMMA)的疫苗平台。该平台产生的OMV直径约35nm，能稳定表达异源多糖抗原，且通过脂质A结构改造(P-MPLA)显著降低内毒素活性。

1 Introduction

肺炎克雷伯菌可导致肺炎、败血症等多种感染，其耐药性问题日益严峻。外膜囊泡(OMV)因其天然佐剂性和纳米尺寸特性成为理想疫苗载体。研究团队通过CRISPR/Cas技术敲除wbbH-L基因簇阻断内源多糖合成，同时改造lpxM/lpxE基因获得减毒脂质A结构，创建了安全高效的geGMMA生产平台。选择占耐药菌株50%以上的O1/O2血清型作为靶抗原。

2 Results

2.1 Preparation and Characterization of Detoxified OMVs

改造菌株的LPS产量提升57-89%，THP-1细胞刺激实验显示TNF-α和IL-8水平显著降低。透射电镜显示OMV粒径约33nm，动态光散射证实颗粒分布均匀。O1/O2多糖在OMV表面的表达量分别达到567.7±77.4μg/L和665.9±61.9μg/L，37℃下可稳定存在7天。Western blot证实多糖抗原成功展示。

2.2 Safety Evaluation of the Vaccines

小鼠实验显示疫苗接种后体温体重稳定，血清IL-6、IL-1β等细胞因子维持在低水平。第30天组织病理学检查未发现心肝脾肺肾异常，血生化指标(BUN、LDH等)均在正常范围，证实疫苗具有良好的生物相容性。

2.3 The geGMMA Vaccine Elicits an Effective Immune Activation

免疫24小时后引流淋巴结中CD40⁺CD80⁺MHC-II⁺树突细胞数量显著增加。第3天CD3⁺和CD4⁺T细胞明显增殖，第7天滤泡辅助T细胞(Tfh)和生发中心B细胞(GL7⁺CD95⁺)比例升高，显示疫苗能有效激活体液免疫。

2.4 Protective Effect of the geGMMA Vaccine

三针免疫后O1-OMV组抗KP041 LPS的IgG滴度提升超1000倍，IgG2a/IgG1比值显示Th1/Th2平衡应答。攻毒实验显示肝脏脾脏细菌负荷降低2-3个数量级，代谢监测显示免疫组氧耗更高，体重损失仅1.3g，显著优于对照组。

2.5 Protective Effect of the Bivalent geGMMA Vaccine

双价疫苗(O1-OMV+O2-OMV)对KP041和KP355攻毒均表现出显著保护，各器官细菌负荷显著降低。免疫后5周抗体滴度仍维持高位，证实能诱导长效免疫记忆。

3 Discussion

该研究创新性地将细菌多糖合成途径与OMV平台相结合，相比传统方法具有三大优势：1)利用大肠杆菌底盘简化生产；2)基因减毒确保安全性；3)模块化设计便于扩展其他病原体抗原。未来可通过"即插即用"技术整合蛋白抗原，或开发黏膜给药途径。

4 Conclusions

研究成功构建了安全高效的geGMMA疫苗平台，制备的双价OMV疫苗对肺炎克雷伯菌感染具有显著保护作用，为应对抗生素耐药危机提供了新思路。该平台技术可扩展应用于其他病原体疫苗研发。