喜马拉雅药用植物胡黄连(Picrorhiza kurrooa)原生质体高效分离及PEG介导的瞬时基因表达体系优化研究

来自喜马拉雅地区的研究人员针对高海拔药用植物胡黄连(Picrorhiza kurrooa)原生质体制备难题，通过优化纤维素酶(2%)和离析酶(0.6%)浓度、甘露醇(0.6 M)渗透压稳定及4小时暗培养条件，成功获得2.9×107个/g FW的高活力(88.04%)原生质体。采用40% PEG4000介导的瞬时转化效率达27.33%，并证实PkWOX11-GFP融合蛋白的核定位特征，为CRISPR核糖核蛋白介导的无外源基因植物改良提供了关键技术平台。

　　

在植物分子生物学研究中，原生质体分离(protoplast isolation)和瞬时基因表达(transient gene expression)技术已成为解析蛋白质亚细胞定位(subcellular localization)、鉴定转录因子(transcription factors)、阐明基因功能(gene function characterization)以及开展单细胞组学(single-cell omics)研究的关键工具。针对喜马拉雅地区重要药用植物胡黄连(Picrorhiza kurrooa)，研究人员系统优化了其原生质体制备体系。

通过精确调控纤维素酶(cellulase 2%)和离析酶(macerozyme 0.6%)的酶解浓度，配合0.6 M甘露醇(mannitol)作为渗透压稳定剂(osmotic stabilizer)，在4小时暗培养条件下，每克鲜重可获得高达2.9×10⁷个、存活率达88.04%的高质量原生质体。显微观察和活力检测证实这些原生质体完全适用于植物遗传转化(genetic transformation)研究。

在聚乙二醇(PEG4000)介导的瞬时转化体系中，40%浓度可获得27.33%的转化效率(transformation efficiency)。特别值得注意的是，WUSCHEL相关同源盒(WUSCHEL-related homeobox, WOX)基因家族成员PkWOX11与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达实验，清晰显示出该蛋白在细胞核(nucleus)中的特异性定位，充分验证了该转化系统的可靠性。

这项研究建立的优化方案，为应用CRISPR核糖核蛋白(CRISPR ribonucleoprotein)技术培育无外源基因(transgene-free)的药用植物遗传改良品种提供了重要技术支撑，对高附加值药用植物的分子育种具有重要实践意义。