基于疏水-柔性理性修饰策略提升黑曲霉果糖基转移酶活性及低聚果糖合成效率的研究

为解决工业酶催化效率低下的瓶颈问题，广西民族大学化学化工学院团队通过计算机辅助设计对黑曲霉果糖基转移酶(FTases)的疏水-柔性活性域进行理性修饰。研究成功构建突变体142P，其酶活性较野生型提升22.56%(45.55 μkat)，最优催化条件为55°C、pH5.0，并显著降低Km值(6.174±0.15 M)。分子对接显示活性域灵活性增强和葡萄糖亲和力降低是提升低聚果糖(FOS)转化率(达29.20%)的关键，为功能性食品工业提供了高效酶改造策略。

　　

在功能性食品和医药领域，低聚果糖(FOS)因其促进肠道益生菌生长、降低胆固醇等健康功效备受关注。传统植物提取法存在季节限制和降解风险，而利用果糖基转移酶(FTases)催化蔗糖转果糖基化反应成为更具前景的工业化路径。然而野生型FTases普遍存在催化效率低下、产物抑制明显等问题，成为制约产业发展的关键瓶颈。

针对这一挑战，广西民族大学化学化工学院的研究团队创新性地提出"疏水-柔性理性修饰"策略，通过计算机辅助设计对黑曲霉(Aspergillus niger)来源的FTases进行精准改造。这项发表于《LWT》的研究，首次将B-factor(表征蛋白质柔性的晶体学参数)分析与活性域疏水性改造相结合，为工业酶理性设计提供了新思路。

研究人员采用多学科交叉技术手段：通过SWISS-MODEL和CB-DOCK2双服务器预测活性域，基于疏水性和B-factor能量筛选突变位点；利用定点突变构建12种变体；采用Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化酶蛋白；结合HPLC分析酶活性和FOS组分；运用分子对接和结构可视化解析构效关系。

在"3.1 突变位点筛选"部分，研究通过蛋白plus服务器和CB-DOCK2预测获得27个活性位点，筛选出9个共有位点。基于疏水氨基酸替换和B-factor能量提升原则，最终选定12个突变体，其中142P(第142位丝氨酸突变为脯氨酸)表现最为突出。

"3.2 表达与酶活性分析"显示，142P的酶活性达45.55 μkat，较野生型(37.17 μkat)提升22.56%。SDS-PAGE验证所有突变体均在68.04 kDa处出现清晰条带，与理论分子量相符。

"3.3 酶学性质分析"揭示了142P的优越特性：最适温度55°C(野生型60°C)，在高温下稳定性显著提高；最适pH5.0的酸性条件；Co²⁺和Cu²⁺可增强其活性；在125 mg/mL高蔗糖浓度下仍保持高活性，远超野生型的50 mg/mL阈值。

"3.4 酶动力学参数分析"发现142P的Km值(6.174±0.15 M)高于野生型，表明其与底物亲和力降低，但kcat(2.115±0.05 s^-1)显著提升，说明催化效率改善。分子对接显示142P与蔗糖的相互作用键减少至7个，有利于底物解离和后续反应。

"3.5 FOS转化与组分分析"取得突破性成果：142P催化500 g/L蔗糖时，FOS转化率从野生型的0.17%飙升至29.20%，其中1-蔗果三糖(1-Kestose)和蔗果四糖(Nystose)分别占14.92%和14.27%。关键机制在于142P与葡萄糖的相互作用键从野生型的11个减少至6个，有效缓解产物抑制。

通过"3.6 分子对接与结构分析"，研究阐明了分子机制：B-factor能量分析显示142P活性域能量分布更广(0.963)，增强构象灵活性；Trp242和Arg154被鉴定为驱动FOS延伸的关键残基，142P-242K双突变体使FOS转化率进一步提升至52%。

这项研究开创性地将疏水-柔性双原则应用于FTases改造，证实活性域适度柔性化可突破工业酶催化瓶颈。所获142P突变体在催化效率、热稳定性和产物耐受性方面均显著提升，为功能性低聚糖规模化生产提供了高效生物催化剂。该策略还可推广至其他工业酶设计，对推动食品、医药等领域的酶工程发展具有重要指导意义。