三维动态摇动培养促进犬化学诱导肝祖细胞再成熟及其功能研究

为解决犬肝细胞长期培养功能维持难题，研究人员通过3D摇动培养系统成功实现犬肝祖细胞(cHPCs)再成熟，显著提升ALB、CYP2E1等肝特异性基因表达（最高达63倍），为犬肝病模型构建和药物毒性测试提供新平台。

　　

肝脏作为机体的代谢中枢，其功能障碍将直接威胁生命健康。在犬类中，随着寿命延长，慢性肝炎、肝硬化等肝病发病率持续攀升，但现有治疗手段效果有限——例如肝硬化患犬中位生存期仅22天。更严峻的是，药物开发过程中大量健康犬因肝毒性测试被安乐死，而传统二维(2D)培养的肝细胞难以维持长期代谢功能。这一困境催生了科学家对人工肝系统的探索：能否通过细胞重编程技术获得具有自我更新能力的肝祖细胞，再将其诱导为功能成熟的肝细胞？

日本麻布大学兽医内科实验室的Kaoruko Kikuchi团队在《Regenerative Therapy》发表的研究给出了肯定答案。研究人员利用ROCK抑制剂(Y-27632)、TGFβ抑制剂(A-83-01)和GSK3抑制剂(CHIR99021)将冷冻保存的犬肝细胞重编程为化学诱导肝祖细胞(cHPCs)，随后创新性地采用三维(3D)摇动培养系统（15 rpm），使这些细胞成功再分化为具有成熟肝细胞特征的球体。

研究主要运用了三大关键技术：通过AggreWell400^TM板构建3D球体、动态摇动培养系统（15 rpm转速）、以及qRT-PCR和免疫荧光对肝特异性标志物(ALB/AFP/CYP2E1等)的系统评估。实验采用8.1 kg雄性比格犬来源的冷冻肝细胞，在三维培养5天后即形成直径150 μm的不规则边缘球体。

【形态学特征】

2D培养组细胞呈现典型铺路石样形态，而3D培养组球体边缘出现"出芽"样增殖。这种独特形态可能暗示球体内存在未分化细胞亚群，为后续研究提供新线索。

【基因表达谱】

3D培养展现出压倒性优势：白蛋白(ALB)表达提升63倍，药物代谢酶CYP3A12升高56倍，转运蛋白MRP2增加34倍。值得注意的是，尽管成熟标志物显著上调，胎蛋白(AFP)表达仍维持高水平，提示细胞处于"功能成熟但保留祖细胞特性"的特殊状态。

【蛋白表达验证】

免疫荧光显示3D培养组87.6%细胞表达AFP，100%表达CYP2E1，显著高于2D组（11.4%和7.9%）。这种"双阳性"特征与基因表达谱相互印证，证实3D系统更利于维持肝细胞功能。

这项研究的突破性在于首次建立犬肝祖细胞再成熟体系，其创新的动态培养方法解决了传统静态培养营养分布不均的痛点。相比Nantasanti团队此前开发的犬肝类器官，本研究获得的球体具有更活跃的药物代谢功能（CYP3A12表达量提升56倍），这对构建犬类药物肝毒性预测模型具有里程碑意义。

讨论部分指出，虽然3D球体仍保留AFP阳性等祖细胞特征，但其强大的药物代谢能力（CYP2E1阳性率100%）已能满足基础研究和临床前测试需求。研究者特别强调，这种无需特殊设备的简易培养方案，使得大规模生产功能性犬肝球体成为可能，为兽医领域的肝病治疗、药物筛选和器官移植研究开辟了新途径。未来研究需进一步优化培养条件，推动该技术向临床转化应用。