极端嗜热古菌Pyrodictium abyssi中形成管状结构的CanA蛋白的生物物理特性及溶液结构解析

研究人员针对极端嗜热古菌Pyrodictium abyssi胞外蛋白网络的主要成分CanA开展研究，通过NMR解析其非聚合突变体K1-CanA的溶液结构，发现其具有非典型果冻卷I类折叠特征，并鉴定出Mg2+/Ca2+结合位点BA1和BA2。该研究揭示了离子结合诱导构象选择机制启动CanA聚合的分子基础，为纳米生物技术应用提供理论支撑。

　　

在深海热液喷口等极端环境中生存的嗜热古菌Pyrodictium abyssi，能形成独特的胞外管状网络结构——cannulae。这些中空纤维由糖蛋白亚基组成，具有惊人的热稳定性（耐受401K高温），其形成机制与古菌细胞分裂和群体行为密切相关。然而，作为主要结构单元的CanA蛋白如何响应二价离子信号完成自组装，其三维结构基础与动力学特征长期未明。

德国雷根斯堡大学生物物理与物理生物化学研究所（Institute of Biophysics and Physical Biochemistry, University of Regensburg）的研究团队通过多学科交叉方法，首次解析了CanA蛋白的溶液结构及其聚合调控机制。研究采用NMR技术测定非聚合突变体K1-CanA的原子级结构，结合冷冻电镜（cryo-EM）解析天然CanA的聚合态结构，发现其具有独特的非典型果冻卷I类（jellyroll class I）折叠模式。通过[¹H,¹⁵N]-SOFAST-HMQC谱追踪离子结合过程，揭示Mg²⁺/Ca²⁺通过构象选择机制触发N端结构域释放，进而启动多步聚合反应。该成果发表于《Scientific Reports》，为设计热稳定纳米生物材料提供新思路。

关键技术方法包括：（1）利用限域蛋白酶切获得稳定突变体K1-CanA；（2）多维NMR技术（HNCA、CBCANH等）解析溶液结构；（3）冷冻电镜（7UII）获取聚合态结构；（4）化学位移扰动（CSP）分析离子结合位点；（5）扩散排序NMR测定寡聚状态。

Structure of K1-CanA and CanA

通过TEM观察到重组CanA在二价离子（10 mM CaCl₂/MgCl₂）诱导下形成直径25-35 nm的规则管状结构，周期4.4 nm^-1。FT-IR和CD证实聚合过程未改变蛋白二级结构。NMR解析的K1-CanA结构显示其含13个β链（β₁-β₁₃）和2个α螺旋（α₁-α₂），其中8个β链构成非典型果冻卷折叠，β片层B1（β₁β₃β₅β₇β₁₁）与B3（β₄β₈β₁₃）的拓扑排列不同于经典模式（图5）。

Oligomer and polymer formation

扩散实验显示CanA在pH 9.0时形成表观分子量64.63 kDa的寡聚体。实时NMR监测发现聚合过程符合双指数动力学（k_pol,1=0.19 ms^-1，k_pol,2=0.03 ms^-1），临界浓度为2.48 μM。值得注意的是，N端截断的K1-CanA完全丧失聚合能力，提示前11个残基对组装至关重要。

Binding sites for divalent ions

化学位移扰动鉴定出两个结合区域：BA1（D57/E97/D114/E116/G183）对Ca²⁺亲和力（K_D≈0.7 mM）显著高于Mg²⁺（K_D≈3.6 mM）；BA2（D42/D140/E164/D169）则对两种离子亲和相近（K_D≈4-28 mM）。K115和E116的化学位移变化最显著（Δδ^comb>0.2 ppm），暗示其直接参与配位（图14）。

研究结论指出，CanA通过非典型果冻卷折叠形成刚性骨架，其N端在溶液中与BA1区域动态结合。当环境Ca²⁺/Mg²⁺浓度达到阈值时，离子结合诱导BA1构象变化，释放N端并暴露蛋白-蛋白相互作用界面。这种构象选择机制（conformational selection）分两步完成：快速形成寡聚核心后，缓慢重组为成熟管状结构。与冷冻电镜结构比对发现，聚合过程中β片层B2和α螺旋α₂发生显著重排，这些构象变化为设计温度响应型纳米管提供靶点。该工作不仅阐明极端环境微生物的适应策略，其揭示的"离子开关"机制可指导开发新型生物纳米管，在靶向给药、生物传感器等领域具有应用潜力。