利用天然纳米盘分离活性TRPC3通道并拓展结构分析能力的研究

本研究针对TRP家族成员TRPC3通道开放构象结构信息缺失的难题，创新性地评估了新型提取剂与传统去垢剂对HEK293、Komagataella phaffii和Expi293F细胞中功能性TRPC3复合物的分离效果。研究发现Expi293F细胞是最佳表达系统，十二烷基二葡萄糖苷(DDDG)和正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)能有效提取TRPC3，并通过电镜、质谱和膜片钳证实纯化的TRPC3保持了四聚体结构和活性，为TRPC3功能研究和药物开发提供了新方法。

　　

在细胞信号转导领域，瞬时受体电位经典通道3（TRPC3）作为重要的钙离子通道，参与从神经传导到心脏节律调控等多种生理病理过程。然而长期以来，科学家们面临一个关键瓶颈——尽管通过冷冻电镜（cryo-EM）已获得TRPC3的高分辨率结构模型，但这些结构都捕捉的是通道的关闭状态，其开放孔道构象始终是个未解之谜。这种结构信息的缺失严重阻碍了对TRPC3功能机制的理解和靶向药物开发。

奥地利格拉茨医科大学（Medical University of Graz）的Jasmin Baron和Oleksandra Tiapko领衔的研究团队在《Scientific Reports》发表的重要研究中，创新性地提出两个关键科学问题：通道对脂质环境的强烈依赖性，以及短暂开放状态的技术捕获难度。TRPC3的功能高度依赖胆固醇、二酰基甘油（DAG）和磷脂酰肌醇二磷酸（PIP₂）等脂质分子，传统纯化过程可能破坏这些关键相互作用；同时通道开放状态持续时间仅约0.2毫秒，给结构解析带来巨大挑战。

研究人员采用多学科交叉方法开展研究：通过荧光显微镜和Western blot验证不同表达系统中TRPC3的定位；采用BCA检测和Western blot系统比较六种提取剂的效率；运用负染电镜（nsEM）分析四聚体结构完整性；通过靶向脂质组学分析共纯化脂质种类；最后采用单通道膜片钳技术验证通道功能活性。特别值得注意的是，研究首次将纳米盘形成小分子两亲性物质DDDG与传统去垢剂DDM进行平行比较。

表达系统优化结果显示，Expi293F悬浮细胞相比传统HEK293贴壁细胞和K. phaffii酵母，能产生更高产量的TRPC3蛋白（0.15 mg/mL vs 0.05 mg/mL）。Western blot分析揭示DDDG和DDM在Expi293F系统中提取效率最佳，而两亲性共聚物DIBMA在HEK293细胞中表现突出。有趣的是，虽然K. phaffii系统中DIBMA和DDM提取效率较高，但由于缺乏胆固醇合成能力（仅产生麦角固醇），最终被排除在后续实验之外。

结构表征方面，负染电镜图像清晰显示，无论使用DDDG还是DDM提取，纯化的TRPC3都保持了典型的"花形"四聚体结构，与已报道的冷冻电镜结构（如PDB:7DXB）高度一致。脂质组学分析发现，DAG、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）等关键脂质被成功保留，但令人意外的是检测到大量非质膜典型的甘油三酯（TG），推测可能是提取过程中非特异性掺入的结果。值得注意的是，胆固醇这一TRPC3功能调节关键分子在两种提取条件下均未检出，可能与非离子型去垢剂难以溶解脂筏结构有关。

功能验证实验取得突破性发现。将纯化的TRPC3重组到人工合成的二植烷酰磷脂酰胆碱（DPhPC）双层膜中，单通道记录显示其电导率（γ_TRPC3/DDDG=52.2±1.6 pS；γ_TRPC3/DDM=53.8±1.7 pS）和门控特性（包括亚稳态和开放态占比）与HEK293细胞中表达的TRPC3（γ_TRPC3/HEK=54.0±1.2 pS）无显著差异。激动剂GSK1702934A（10-20 μM）诱导的电流特征和抑制剂Pyr10的阻断效应在两种体系中高度一致，证实纯化过程保留了通道的完整功能。

这项研究的意义在于：首次系统评估了不同表达系统和提取剂对TRPC3结构和功能的影响，确立了Expi293F-DDDG/DDM组合为最优方案；证实通过温和提取条件可以保留TRPC3的关键脂质环境和功能状态，为后续冷冻电镜解析开放构象奠定基础；发现TG的非特异性共纯化现象为膜蛋白纯化工艺优化提供了新思路。研究也存在一定局限，如未能保留胆固醇的共纯化，这可能通过添加胆固醇类似物或优化提取剂组合来解决。

该成果不仅为TRPC3的结构功能研究建立了可靠技术体系，其方法论对其它脂质依赖性膜蛋白研究也具有重要借鉴价值。特别是DDDG这种能形成天然纳米盘的小分子两亲性物质，展现出替代传统去垢剂和聚合物的潜力。未来研究可在此基础上，通过引入胆固醇和PIP₂等关键脂质，进一步提高TRPC3开放构象的捕获概率，为开发靶向TRPC3的心血管和神经系统疾病药物提供精确结构模板。