RAPPL技术：一种快速、简便且经济的核糖体分离方法及其在翻译机制结构与功能研究中的应用

研究人员针对传统核糖体分离方法耗时长、成本高且需要大量生物材料的局限性，开发了名为RAPPL（RNA affinity purification using poly-lysine）的新型核糖体纯化技术。该技术利用多聚赖氨酸与RNA磷酸骨架的静电作用，可在45-60分钟内从多种样本（细胞裂解液、器官或完整生物体）中高效分离功能性核糖体及翻译相关因子。研究成功应用于尿路致病性大肠杆菌耐药机制研究和新型隐球菌2.7?冷冻电镜结构解析，为翻译机制研究提供了通用平台。

　　

在生命科学领域，核糖体作为负责蛋白质合成的RNA-蛋白质复合体，其结构与功能研究一直是科学家关注的焦点。然而传统核糖体分离方法如蔗糖垫超速离心和多核糖体图谱分析存在明显局限：不仅需要昂贵设备（超速离心机、转子和分馏器），耗时长达数小时，而且对起始材料要求苛刻——当处理低丰度样本时，往往需要额外纯化步骤导致珍贵样本损失。更棘手的是，长时间处理会增加氧化或温度波动风险，影响样本稳定性。这些技术瓶颈严重制约了从临床样本到模式生物等广泛领域的翻译机制研究。

针对这一挑战，华盛顿大学医学院细胞生物学与生理学系（Washington University School of Medicine）的Jessey Erath等研究人员开发了名为RAPPL（RNA affinity purification using poly-lysine）的革命性技术。这项发表在《Nature Communications》的研究，通过利用多聚赖氨酸与RNA磷酸骨架的静电相互作用，建立了一种可在1小时内完成核糖体纯化的通用方法。研究证明该技术不仅适用于从微量样本（低至5,000个哺乳动物细胞）中高效回收功能性核糖体，还能保持翻译复合体的结构完整性，成功解析了新型隐球菌2.7?高分辨率冷冻电镜结构，为翻译机制研究开辟了新途径。

研究团队主要采用四项关键技术：1）多聚赖氨酸磁珠亲和纯化技术，利用阳离子氨基酸与RNA磷酸骨架的静电作用；2）冷冻电镜（cryo-EM）结构解析，包括从新型隐球菌样本制备到2.7?分辨率图谱重建；3）体外翻译功能验证系统（PURExpress?），评估分离核糖体的翻译活性；4）质谱蛋白质组学分析，鉴定RAPPL富集的81种人源和51种大肠杆菌核糖体相关蛋白。临床样本包括尿路致病性大肠杆菌患者分离株（Ec13和Ec24）和基因工程菌株（SQ110 ΔTC 16S - A1408G和SQ110 ΔTC 23S - A2058G）。

【RAPPL概述】研究团队设计了一种基于阴离子交换和亲和纯化的策略，利用生理pH7.5条件下多聚赖氨酸ε-氨基正电荷与RNA负电骨架的相互作用。通过优化洗涤条件（不含去污剂）和竞争性洗脱（采用聚-D/L-谷氨酸），整个流程仅需45-60分钟，比传统方法效率提升显著。透射电镜证实该方法能有效捕获完整核糖体，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示从HEK-293、人真皮成纤维细胞和HeLa细胞中成功分离28S/18S rRNA。

【RAPPL富集核糖体及相关因子】Western blot和质谱分析揭示，RAPPL能特异性富集核糖体蛋白（如uS13-Flag和uL4-HA）及翻译相关因子（如eIF3复合物13个成员）。定量质谱显示人源样本中81种已知核糖体相关蛋白占洗脱蛋白总量的30%，而大肠杆菌样本中70%洗脱蛋白为核糖体组分。RNA酶预处理实验证明该方法可区分真正翻译复合体与mRNA结合蛋白。

【微量样本适用性】研究突破性地证明RAPPL可从极微量样本中分离核糖体：透射电镜显示能从13nM稀释度的PureExpress?核糖体中捕获颗粒；Western blot证实可从低至1×10³个HA标记的HEK-293细胞中检测到信号；恶性疟原虫实验中，仅需1×10⁶个寄生虫细胞即可获得足够分析材料。

【多物种适用性】该方法成功应用于12种生物系统：原核生物（大肠杆菌）、真核微生物（酿酒酵母、弓形虫、恶性疟原虫、隐孢子虫、新型隐球菌）、哺乳动物细胞系（HEK-293、HeLa、HDF）、模式生物（斑马鱼、秀丽隐杆线虫）和小鼠器官（脾脏、肝脏）。针对不同样本特性调整裂解方案：如对细胞壁生物采用珠磨破碎，对疟原虫使用钾乙酸缓冲液解离内质网结合核糖体。

【功能验证】体外翻译实验证实RAPPL分离的核糖体保持生物活性：大肠杆菌核糖体能在PURExpress?系统中合成eGFP报告蛋白，动力学检测显示与传统方法分离的核糖体活性相当。抗生素敏感性实验揭示，从临床分离株Ec24获得的核糖体具有红霉素（ERY）和克林霉素（CLI）耐药性，而Ec13的耐药性源于外排泵机制，证实RAPPL可用于区分核糖体介导与非核糖体介导的耐药性。

【结构生物学应用】研究首次解析了新型隐球菌80S核糖体2.7?冷冻电镜结构。从1×10⁸个酵母细胞中RAPPL纯化的核糖体，经2D分类获得294,300个颗粒，最终重构出40S小亚基（EMD-47217）、60S大亚基（EMD-47218）及40S头部（EMD-47219）的高分辨率图谱，证明该方法适用于冷冻电镜样本制备。

这项研究建立的RAPPL技术突破了传统核糖体分离方法的时空限制和样本量瓶颈。其创新性体现在三个方面：首先，将纯化时间从数小时缩短至1小时内，大幅降低样本降解风险；其次，起始材料需求降低10-100倍，使临床样本和珍贵生物材料研究成为可能；第三，保持翻译复合体天然状态，兼容功能分析（体外翻译）、结构解析（冷冻电镜）和机制研究（抗生素耐药）。特别值得注意的是，该方法能同时捕获胞质和线粒体核糖体，为研究核糖体生物发生和细胞器特异性翻译调控提供新工具。研究者预见，这项技术在学术研究（如稀有病原体研究）、临床诊断（快速耐药性检测）和药物开发（高通量翻译抑制剂筛选）领域具有广泛应用前景。正如通讯作者Sergej Djuranovic和Slavica Pavlovic Djuranovic强调的，RAPPL不仅是一种方法学突破，更为探索翻译调控的分子机制开辟了新维度。