克氏锥虫疫苗候选靶点TcPOP开放与闭合构象的冷冻电镜解析及其免疫原性研究

本研究针对南美锥虫病（Chagas disease）缺乏有效疫苗的现状，聚焦病原体克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的关键毒力因子80 kDa脯氨酰寡肽酶（TcPOP），通过冷冻电镜首次解析其3.6-3.8 ?分辨率的开放/闭合构象，结合等离子体光镊与氢氘交换质谱揭示动态构象变化。研究人员发现抗TcPOP多克隆血清能通过裂解作用阻断寄生虫入侵（中和效率>95%），并鉴定出具有中和活性的单克隆抗体，为开发首个基于结构指导的南美锥虫病疫苗奠定基础。

　　

南美锥虫病（Chagas disease）是由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的致命性寄生虫病，全球感染者超600万，每年导致1.2万人死亡。现有药物硝呋莫司和苯并硝唑仅对急性期有效，且会产生致盲、不育等严重副作用。更棘手的是，该寄生虫能通过分泌脯氨酰寡肽酶（Prolyl oligopeptidase, POP）降解宿主细胞外基质，协助入侵并建立终身感染。尽管TcPOP早在20年前就被鉴定为疫苗候选靶点，但其结构动态特征与免疫保护机制始终未明。

来自英国莱斯特大学（University of Leicester）等机构的研究团队通过多学科交叉策略，首次揭示了TcPOP的分子奥秘。研究采用细菌发酵克服了TcPOP低表达难题（产量从0.05 mg/L提升至0.8-2.0 mg/mL），通过冷冻电镜（cryo-EM）成功捕获该酶在溶液中的开放与闭合构象，全局分辨率分别达到3.6 ?和3.8 ?。令人惊喜的是，免疫小鼠实验显示抗TcPOP多克隆血清能通过结合内吞/外泌途径诱发寄生虫裂解，72小时内将感染率降低99%；而分离的单克隆抗体IM1-mAb1虽不引起裂解，但通过空间位阻仍实现50%中和效果。相关成果发表于《Nature Communications》。

关键技术包括：（1）冷冻电镜结合30°-35°倾斜技术解决小分子（73.4 kDa）取向偏好问题；（2）氢氘交换质谱（HDX-MS）定量分析7个蛋白区域的构象转换动力学；（3）等离子体纳米光镊实时监测单分子构象波动；（4）SEC-SAXS（尺寸排阻-小角X射线散射）验证溶液状态构象；（5）BLI（生物层干涉）技术测定抗体-抗原结合动力学（KD达皮摩尔级）。

主要研究结果

表达纯化与免疫原性验证

重组TcPOP在E. coli中成功表达并保持酶活性（图1a）。SEC-MALS证实其为单体（73.4±2.1 kDa），差示扫描荧光法（DSF）显示Tm>50℃。小鼠免疫实验显示多克隆血清与T. brucei（TbPOP）、L. infantum（LiPOP）存在交叉反应，但不识别人源同源物（HuPOP）（图S6a）。

多克隆血清的裂解机制

活体结合实验显示，5% IM1S血清5分钟内即可使锥虫鞭毛袋周围肿胀，15分钟完成裂解（图2e）。免疫荧光证实抗体主要结合分泌途径囊泡，与慢性感染血清的弥散性结合模式截然不同（图2c）。

单克隆抗体的中和特性

从高效价小鼠分离的IM1-mAb1（KD=3.2 nM）虽结合力弱于mAb2/3（KD<1 pM），但能特异性结合鞭毛（图3g），通过空间位阻抑制感染。质谱光散射显示1:1复合物占比仅1-2%（图3e），提示表位暴露有限。

构象动态的结构基础

冷冻电镜重建显示TcPOP含α/β水解酶域（催化三联体Ser⁵⁴⁸-Asp⁶³¹-His⁶⁶⁷）和七叶β-螺旋桨域（图4a,b）。分子动力学模拟发现192-198和306-333位残基柔性最高，Gibbs自由能景观显示4-6个亚稳态（图5a）。HDX-MS进一步揭示6个区域存在协同构象转换，其中β-螺旋桨域193-209环以超快速率（半衰期<1000分钟）介导构象开放。

这项研究首次阐明了TcPOP的构象动态与免疫保护机制的关系：①开放构象暴露的α/β水解酶域可能含优势表位；②多克隆血清通过囊泡靶向引发裂解，而单抗通过表面结合实现中和；③TcPOP在寄生虫所有生活史阶段（锥鞭毛体、无鞭毛体、上鞭毛体）的分泌途径中均有分布，具备广谱疫苗潜力。研究人员建立的"冷冻电镜-DynaMight动态建模-HDX-MS验证"技术路线，为其他小分子量（<80 kDa）分泌蛋白的结构解析提供了新范式。未来可基于构象特异性表位设计疫苗，或开发锁定闭合构象的小分子抑制剂，为抗击南美锥虫病提供双轨策略。