黏连蛋白通过调控底物可及性抑制人源拓扑异构酶IIα解链活性的机制研究

本研究揭示了黏连蛋白(cohesin)如何通过稳定DNA交叉结构来抑制人源拓扑异构酶IIα(TOP2α)的解链活性。研究人员利用四重光镊系统构建DNA缠绕模型，首次在单分子水平证实cohesin能稳定结合DNA交叉点并阻碍TOP2α接近底物。该发现阐明了有丝分裂中姐妹染色单体解离的调控新机制，为理解染色体分离异常相关疾病提供重要线索。

　　

DNA拓扑结构的精确调控是细胞分裂的核心命题。在细胞准备将复制后的染色体分配给子细胞时，姐妹染色单体间数以千计的DNA缠绕必须被拓扑异构酶IIα(TOP2α)精确解开。然而令人困惑的是，这些缠绕在分裂前期始终与黏连蛋白(cohesin)复合物共存——这种维持姐妹染色单体连接的分子胶，理论上应与解链酶的功能相冲突。这个生物学悖论背后，隐藏着染色体分离时序调控的关键机制。

英国医学研究委员会资助的研究团队在《Nature Communications》发表突破性成果。通过开发创新的四重光镊-荧光联用系统(Q-Trap)，研究人员首次实现DNA缠绕结构的实时观测与力学操控，揭示cohesin通过物理阻碍TOP2α接触DNA交叉点的分子机制。该研究不仅阐明有丝分裂中染色体解离的精确时空调控原理，更建立了研究DNA拓扑调控的单分子技术平台。

关键技术包括：1) 四重光镊系统构建DNA缠绕模型；2) 单分子荧光追踪TOP2α-AF555动态；3) 微流控通道实现多条件快速切换；4) 质谱验证蛋白复合物组装；5) ATP酶活性检测。人类细胞来源的cohesin和TOP2α复合物均通过杆状病毒系统表达纯化。

TOP2α高效解链DNA缠绕的力学特性

通过精确控制DNA张力发现，TOP2α在28 pN张力下解链效率骤降，提示纺锤体拉力可能调控其活性。有趣的是，该酶对右手螺旋缠绕（模拟复制叉旋转产物）展现显著偏好，单次作用可连续解开四个缠绕节点，揭示其处理复制相关拓扑压力的进化适应性。

ATP水解与底物识别的精密耦合

非水解型ATP类似物(ATPyS/AMPPNP)使TOP2α停滞在结合状态却不解链，抗癌药依托泊苷(etoposide)则将其冻结在DNA释放前步骤。关键发现是：预先结合线性DNA的TOP2α在ATP存在时会丧失解链能力，说明其必须直接识别DNA交叉结构才能激活——这解释了为何cohesin的物理阻碍如此有效。

cohesin建立拓扑屏障的分子证据

相较于相关蛋白condensin I，cohesin能特异稳定结合DNA交叉点（停留时间>5分钟）。当cohesin预结合后，即使施加去垢剂SDS破坏蛋白交联，TOP2α仍无法解链，证实cohesin并非简单桥接DNA，而是通过占据交叉点空间阻碍TOP2α的底物识别。

这项研究颠覆了关于姐妹染色单体分离的传统认知：cohesin不仅是物理连接器，更是TOP2α活性的时空调节器。其通过在复制终止区稳定DNA缠绕，既维持姐妹染色单体 cohesion（黏连），又防止TOP2α的过早作用。该机制确保染色体仅在分裂后期、cohesin被分离酶(separase)降解后才完全解链，为基因组稳定性提供双重保障。技术层面，建立的光镊-荧光联用平台为研究其他拓扑调控蛋白开辟新途径。这些发现对理解染色体不稳定性相关疾病（如癌症、发育障碍）具有深远意义。