实时捕获σN转录起始中间体揭示ATP酶驱动有限解折叠激活机制

本研究通过动力学引导的结构分析，揭示了细菌σN转录起始复合物被AAA+ ATP酶激活的分子机制。研究人员开发了新型生化检测方法，证明细菌增强子结合蛋白(bEBP)通过机械力将σN区域I(σN-RI)约30个残基易位穿过DNA气泡，破坏抑制性结构以促进完整转录泡形成。该发现阐明了σ54依赖转录激活的独特机制，为理解病原菌毒力因子表达调控提供了新视角。

　　

在细菌转录起始的复杂调控网络中，σ因子扮演着关键角色。其中σ^N(又称σ⁵⁴)因其独特的激活机制而备受关注——与常见的σ⁷⁰家族不同，σ^N需要专门的AAA+ ATP酶（细菌增强子结合蛋白，bEBP）激活才能启动转录。这种机制在多种人类病原菌（如铜绿假单胞菌、霍乱弧菌等）的毒力因子表达中起关键作用，但长期以来，bEBP如何通过ATP水解产生的机械力激活σ^N的分子细节仍不清楚。

洛克菲勒大学的研究人员通过创新性的实验设计，首次实时捕获了σ^N转录起始过程中的关键中间体。他们发现bEBP如同"分子马达"一般，将σ^N的N端区域(σ^N-RI)像"穿针引线"般拉过DNA气泡，破坏σ^N的自抑制结构，最终促使RNA聚合酶形成完整的转录泡。这项突破性研究发表在《Nature Communications》上，为理解细菌转录调控提供了全新视角。

研究团队运用了多项关键技术：1）基于荧光增强(PIFE)的停流动力学分析确定反应时间节点；2）低温电子显微镜(cryo-EM)在35秒关键时间点捕获中间体结构；3）创新性设计蛋白酶体偶联的蛋白降解实验定量易位程度；4）Edman降解测序精确定位切割位点；5）体外转录实验验证突变体功能。

研究结果部分，通过"Kinetics-informed capture of actively initiating Eσ^N-bEBP complexes by cryo-EM"实验，研究人员发现反应35秒时存在三类复合物：未激活的早期熔链中间体(RP_em，31%)、bEBP结合复合物(55%)和已熔链的RPo样复合物(14%)。关键发现是bEBP通过其GAFTGA孔环形成螺旋排列，每次ATP水解使σ^N-RI移动两个残基，如同"齿轮"般逐步解折叠σ^N。

在"bEBP-mediated unfolding and threading of σ^N-RI halts at a defined position"部分，创新的蛋白酶体降解实验显示，完整转录复合物中bEBP仅易位约30个残基即停止，而单独σ^N会被完全降解。Edman测序证实切割发生在SQQ/LA位点，电荷分析表明σ^N-RI第30位后负电荷增加可能促使bEBP解离。

"Pre- and post-catalytic states of bEBP nucleotide hydrolysis suggest a single subunit mechanism"揭示了ATP水解的分子细节：仅第二个亚基(e)处于预催化状态，精氨酸指(R299)稳定γ-磷酸；水解后ADP结合导致精氨酸指移出活性位点，符合AAA+蛋白"手递手"易位机制。

最后两部分展示了σ^N-RII在RNAP活性位点裂隙的独特构象：在RPo中，σ^N-RII像"绳索"般缠绕模板链(t-strand)，而在初始转录复合物(RP_itc)中，这种缠绕位置移动一个碱基，活性位点含有ATP和ADP，触发环折叠准备催化。

这项研究的重要意义在于：1）首次阐明bEBP通过有限易位(约30残基)而非完全解折叠激活σ^N的机制，为理解AAA+蛋白的多样性功能提供范例；2）发现局部电荷变化可能是bEBP解离的信号，拓展了对转录激活终止机制的认识；3）σ^N-RII与模板链的拓扑缠绕为理解启动子逃逸提供了新线索。这些发现不仅深化了对细菌转录调控的理解，也为针对σ^N依赖的病原菌毒力通路开发新型抗菌药物提供了理论依据。