SARS-CoV-2 nsp10-nsp14 ExoN复合体小分子结合的结构基础：抗病毒药物开发新靶点的发现

本研究针对SARS-CoV-2的关键非结构蛋白nsp10-nsp14 ExoN复合体，通过X射线晶体学和片段筛选技术，揭示了其结构动态特征及五个新型小分子结合位点。研究人员发现催化残基His268存在"活性-非活性"构象转换，并鉴定出9个结构相关的片段可靶向nsp10-nsp14界面，为开发干扰病毒RNA校对机制（ExoN）和甲基化功能（N7-MTase）的抑制剂提供了新策略。该成果发表于《Nucleic Acids Research》，为克服新冠病毒对现有核苷类似物（如Molnupiravir）的耐药性开辟了新途径。

　　

新冠病毒（SARS-CoV-2）的持续变异对全球公共卫生构成长期挑战。尽管已有Paxlovid（Nirmatrelvir/Ritonavir组合）和Molnupiravir等抗病毒药物获批，但病毒通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和核酸外切酶（ExoN）组成的"校对机器"不断产生耐药突变。其中，非结构蛋白nsp14作为病毒独有的双功能酶，其N端的3'-5'核酸外切酶（ExoN）可纠正RdRp的错误插入，而C端的N7-甲基转移酶（N7-MTase）参与RNA加帽以逃逸宿主免疫识别。这两个结构域通过柔性铰链区连接，并与支架蛋白nsp10形成关键复合体，成为对抗病毒进化的理想靶点。

英国伦敦大学学院（University College London）与瑞典隆德大学（Lund University）联合团队采用共表达技术获得nsp10-nsp14 ExoN复合体，通过高分辨率（1.3 ?）X射线晶体学捕获了DEDDh家族核酸外切酶特征残基His²⁶⁸的构象开关现象。结合MAX IV实验室的FragMAX平台完成148个片段化合物的筛选，利用显微尺度热泳动（MST）验证结合亲和力，最终发现9个片段可靶向nsp10-N端与nsp14交界面的新型结合口袋。

Structural basis for small molecule binding

晶体结构显示，nsp10-nsp14 ExoN复合体存在P2₁和P2₁2₁2₁两种空间群构象。关键发现是催化三联体中的His²⁶⁸呈现5 ?位移的构象变化：在P2₁2₁2₁晶型中指向活性中心（Glu⁹²），而在P2₁晶型中远离活性位点，这种动态特征与CRN-4等DEDDh家族成员的调控机制相似。

Fragment hits reveal novel binding sites

通过片段筛选鉴定出14个阳性化合物，主要分布在五个新位点：

1. nsp10-nsp14界面主口袋：9个含芳香环的片段（如VT00180，K_d=0.51 mM）与nsp10的Asn³-Thr⁵及nsp14的Val¹⁴-Arg⁵³形成疏水网络

2. 铰链区次级位点：VT00079等3个片段与nsp14的Trp⁸⁶-Arg²⁷⁸相互作用

3. nsp10表面位点：VT00259结合于远离RNA结合面的Thr¹¹¹-Trp¹²³区域

Physicochemical properties

所有片段符合"三规则"（分子量<300 Da，clogP<3），其中VT00249（K_d=0.56 mM）和VT00180显示出最佳结合特性。值得注意的是，消旋体VT00123的R/S对映体分别结合于不同位点，为结构优化提供了独特线索。

该研究首次系统揭示了nsp10-nsp14 ExoN复合体的动态结构特征，证实小分子可通过三种机制干扰病毒功能：

1. 直接抑制ExoN活性：通过稳定His²⁶⁸的非活性构象

2. 破坏蛋白相互作用：靶向nsp10-N端与nsp14的保守界面

3. 变构调控：结合铰链区影响结构域间通讯

这些发现为开发新一代"校对抑制剂"奠定了结构基础，特别是针对nsp10-nsp14界面的片段群，可通过合并策略（Fragment merging）快速提升效价。未来研究可将这些片段与已知的RdRp抑制剂（如Remdesivir）联用，构建针对冠状病毒复制复合体的多靶点治疗方案，对抗不断出现的变异株。