揭示Bacillus subtilis中CspR的tRNA摆动位点2'-O-甲基化机制：结构功能双视角

本研究针对细菌tRNA修饰调控的关键科学问题，解析了Bacillus subtilis中CspR蛋白作为2'-O-甲基转移酶的结构与功能特性。通过X射线晶体学首次捕获CspR-tRNA复合物构象，阐明其依赖ms2i6A37修饰的特异性识别机制，为tRNA修饰网络研究提供新范式。

　　

在生命活动的精密调控中，tRNA作为遗传信息解码的关键分子，其化学修饰直接影响蛋白质合成的准确性。其中，tRNA反密码子环（ASL）的2'-O-甲基化修饰尤为关键，这种修饰能稳定密码子-反密码子配对，促进核糖体易位。然而，不同细菌中这类修饰酶的底物特异性及其分子机制仍存在诸多未解之谜。特别值得注意的是，Bacillus subtilis中预测的TrmL同源蛋白CspR是否具有相似的催化功能，以及其如何识别特定tRNA底物，一直是领域内亟待阐明的重要科学问题。

韩国光州科学技术院（Gwangju Institute of Science and Technology, Korea）的研究团队通过多学科交叉研究，首次证实CspR是B. subtilis中负责tRNA摆动位点2'-O-甲基化的关键酶。研究不仅解析了CspR与tRNA^Leu(UAA)复合物的高分辨率晶体结构（3.18 ?），还通过基因互补实验和体外甲基化分析，系统阐明了该酶依赖ms²i⁶A₃₇修饰的特异性催化机制。相关成果发表于《Nucleic Acids Research》，为理解tRNA修饰的进化保守性提供了结构基础。

研究人员采用基因敲除回补、HPLC/LC-MS修饰分析、X射线晶体学（包括2.9 ? SAH结合结构和3.18 ? tRNA复合物结构）、定点突变等功能验证技术，结合体外转录tRNA重建系统，全面解析了CspR的酶学特性。研究队列包括B. subtilis野生型、ΔcspR和ΔmiaA突变株，以及E. coli ΔtrmL表达的tRNA底物。

Structural and functional characterization of CspR

晶体结构显示CspR形成特征性的SPOUT超家族结状折叠，二聚体界面面积达1481 ?²。与游离状态相比，tRNA结合诱导K49-Y55环发生显著的构象变化，形成特异性结合口袋。

Interactions between CspR and tRNA^Leu(UAA)

复合物结构首次揭示U33、cmnm⁵U₃₄、A₃₅和ms²-i⁶A₃₇四个碱基向外翻转的独特构象。Arg₁₃₅通过阳离子-π作用识别U₃₃，其胍基与U₃₄的O2/N3/O4形成氢键网络，而ms²-i⁶A₃₇的异戊烯基则嵌入由Phe₄₁-Trp₅₆形成的疏水口袋。

Cofactor binding pocket

Sinefungin的氨基距离cmnm⁵U₃₄的2'-OH仅4.0 ?，Arg₂₄'通过盐桥激活核糖2'-OH，支持其作为广义碱参与甲基转移的催化机制。

Gene complementation confirms CspR activity

LC-MS分析显示ΔcspR菌株缺失Cm和cmnm⁵Um修饰，回补cspR基因后修饰恢复。ΔmiaA菌株中i⁶A₃₇修饰的缺失同样导致2'-O-甲基化缺陷，证实修饰级联效应。

In vitro methyl transfer assay

体外实验证明CspR可催化tRNA^Leu(UAA)的cmnm⁵Um形成（m/z=346.1261），且能识别异源E. coli tRNA。通过MiaA预修饰引入i⁶A₃₇后，T7转录的tRNA^Leu(CAA)也获得Cm修饰能力。

Mutational analysis

Arg₁₃₅-Ala突变使酶活丧失97%，证实其碱基识别关键作用；Arg₂₄-Ala保留17%活性，提示其可能参与2'-OH去质子化。

该研究不仅首次揭示CspR作为多底物2'-O-甲基转移酶的分子机制，还阐明了细菌中普遍存在的"位置34-37修饰耦合"规律的结构基础。特别值得注意的是，与E. coli TrmL仅识别嘧啶不同，CspR还能甲基化tRNA^Phe(GAA)的G₃₄，这种底物广谱性为tRNA修饰酶的进化研究提供了新视角。从应用角度看，针对CspR-tRNA相互作用界面的设计可能开发出新型抗菌靶点，而其对修饰网络的精确调控机制也为合成生物学中tRNA工程提供了理论支撑。