热稳定位点特异性重组系统tSAGE的开发及其在嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum染色体高效整合中的应用

本研究针对嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum染色体整合效率低下的瓶颈问题，开发了基于Geobacillus Y412MC61重组酶的tSAGE系统，实现了5×103 CFU/μg的高效整合（与自主复制质粒效率相当）。通过该系统构建了包含17种报告基因、50个启动子（含4种诱导型）和5种核糖开关的遗传工具库，并优化了RBS间隔距离（6-7 nt最佳）。该技术将传统4周的整合周期缩短至3天，为纤维素生物炼制工程菌株开发提供了关键工具。

　　

在追求可持续生物能源的道路上，利用微生物将植物生物质转化为燃料和化学品是极具前景的方向。其中，嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum因其卓越的纤维素降解能力和天然产乙醇特性备受关注。然而，该菌株的遗传改造长期面临一个关键瓶颈——将外源DNA稳定整合到染色体中的过程极其耗时，传统同源重组方法需要2-4周才能获得单次稳定整合，严重制约了工程菌株的开发效率。

美国橡树岭国家实验室（Oak Ridge National Laboratory）生物科学部的Nandhini Ashok等研究人员突破性地开发了热稳定位点特异性重组辅助基因组工程（tSAGE）系统。这项发表于《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》的研究，从极端嗜热菌Geobacillus sp. Y412MC61中挖掘出一种能在高温下高效工作的重组酶，成功构建了适用于C. thermocellum的快速染色体整合平台。

研究人员采用的核心技术包括：1）构建含13种attB位点的多联着陆垫菌株AG8235；2）比较10种中温重组酶与Geobacillus Y412MC61重组酶在50°C下的整合效率；3）通过Bxb1重组酶实现质粒骨架切除；4）利用sfGFP（超折叠绿色荧光蛋白）报告系统评估启动子强度；5）建立基于2-氨基嘌呤和木糖的诱导表达系统。

Development of thermophilic site-specific recombination system
研究证实Y412MC61重组酶在50°C下展现惊人效率，整合转化率达2.86×10³ CFU/μg，与自主复制质粒pAMG216（3.32×10³ CFU/μg）相当。中温重组酶仅Bxb1和TG1在高温下保留活性，但效率低两个数量级。测序显示重组发生在预测的TG核心位点，验证了生物信息学预测准确性。

Reporter screening using tSAGE
通过tSAGE整合的17种报告基因中，需氧成熟的sfGFP亮度最高（较最佳黄素蛋白YNP3 FbFp高60倍），而密码子优化的mScarlet-I3（337.1 RFU/OD₆₀₀）成为最亮的红色报告基因。这一发现为后续启动子表征提供了理想工具。

Promoter screening using t-SAGE
在测试的46个启动子中，同源启动子P_{clo1313_1194}驱动sfGFP表达达3426 RFU/OD₆₀₀，是常用P_gapD的8.4倍。异源启动子中，Geobacillus thermodenitrificans的P_{gtng_2506}（1374 RFU/OD₆₀₀）和Thermoanaerobacterium saccharolyticum的P_{tsac_0046}（1124 RFU/OD₆₀₀）表现突出，为代谢通路精细调控提供了梯度选择。

Inducible promoter and riboswitch screening
基于Caldicellulosiruptor bescii木糖诱导系统的改造最为成功，6.25 mM木糖即可引发40倍表达激活。pbuE核糖开关在P_gapD驱动下获得50倍诱导比，显著优于此前报道的质粒版本。而氟化物核糖开关和阿拉伯糖诱导系统在C. thermocellum中未能奏效。

Ribosome binding site library screening
关键发现是RBS（核糖体结合位点）与起始密码子间距为6-7个核苷酸时，P_{clo1313_1194}驱动的表达达到峰值。共识序列AGGAGGA与天然RBS性能相当，为合成生物学元件设计提供了量化标准。

这项研究通过创新性整合Geobacillus重组酶系统，彻底改变了C. thermocellum基因组编辑范式。tSAGE不仅将染色体整合周期从数周缩短至3天，更构建了迄今最全面的嗜热厌氧菌遗传工具库。特别值得关注的是，该技术采用两步重组策略（Y412MC61整合+Bxb1切除）可实现无抗性标记的稳定整合，满足工业菌株安全要求。研究人员建立的启动子-报告基因-RBS标准化数据集，为纤维素乙醇 pathway的模块化重构奠定了基础。这些突破性进展不仅加速了C. thermocellum的代谢工程进程，其技术路线也为其他极端微生物的遗传改造提供了可借鉴的范式。