铜绿假单胞菌中吡啶酮响应转录抑制因子MexR和NaID调控外排泵MexAB-OprM的分子机制研究

本研究揭示了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)毒力因子吡啶酮(PYO)通过直接结合转录抑制因子MexR和NaID解除其对MexAB-OprM外排泵的抑制作用，同时发现NaID通过负反馈调节限制PYO过度合成的双调控机制。该研究阐明了PYO浓度依赖的精确调控网络，为理解细菌耐药-毒力平衡提供了新视角。

　　

在医院的ICU病房里，铜绿假单胞菌这个"顽固分子"造成了约10%的医院获得性感染。这个革兰阴性机会致病菌之所以如此难对付，关键在于它拥有两大"武器"：生物膜形成能力和多重耐药外排泵系统。更令人头疼的是，这两种武器还通过一种名为吡啶酮(PYO)的蓝色毒力因子相互关联。世界卫生组织(WHO)已将其列为亟需新型抗生素的优先病原体，但科学家们对其耐药机制的认识仍存在关键空白。

山东大学微生物技术国家重点实验室的研究人员发现，这种细菌产生的PYO不仅能帮助它形成生物膜，还能神奇地增强对抗生素的抵抗力。通过系统研究，他们揭示了PYO如何像一把"万能钥匙"般同时作用于多个转录调控因子，精细调控外排泵MexAB-OprM的表达。这项重要成果发表在《Nucleic Acids Research》上，为破解细菌耐药-毒力平衡的奥秘提供了新思路。

研究人员运用了多种关键技术：通过基因敲除和回补构建突变株；采用电泳迁移率实验(EMSA)分析蛋白-DNA相互作用；利用表面等离子共振(SPR)和微量热泳动(MST)测定结合亲和力；结合分子对接和分子动力学模拟预测结合位点；通过qRT-PCR检测基因表达；使用药敏试验评估抗生素敏感性。

研究结果部分包含以下重要发现：

PYO是MexAB-OprM介导的抗生素耐药的关键

通过构建△phzA-G(不产生吩嗪)和△phzMSH(不产生PYO)突变株，发现缺失PYO合成显著增加细菌对诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、阿奇霉素(AZM)等抗生素的敏感性。qRT-PCR显示mexA转录水平在△phzA-G中降低约2倍，证实PYO对MexAB-OprM表达的关键调控作用。

NaID和MexR是PYO响应的转录调节因子

EMSA实验表明PYO和其类似物3A2P能剂量依赖性地促使MexR和NaID从mexA启动子解离。非还原性SDS-PAGE显示PYO可氧化MexR形成二聚体，但3A2P无此作用，提示存在氧化依赖和非依赖的双重调控机制。

NaID和MexR通过结合PYO发挥功能

SPR测得PYO与MexR和NaID的解离常数(KD)分别为5.17和7.03μM。竞争性结合实验显示PYO与抗生素新生霉素(NOV)竞争结合相同位点。基因敲除株实验证实PYO通过mexR/nalD增强MexAB-OprM表达。

PYO在MexR和NaID中的结合位点

分子动力学模拟鉴定出MexR关键结合残基(F17、R21、M61)和NaID关键位点(R66、N129、F132)。点突变实验证实这些位点对PYO结合至关重要，如MexR-M61A突变使PYO结合亲和力降低24倍。

高浓度PYO负反馈调节自身合成

研究发现NaID能直接结合phzA2和phzM启动子激活吩嗪合成基因表达。当PYO过量时，会与NaID结合解除其激活作用，形成负反馈回路。MexAB-OprM缺失导致PYO产量增加，而mexR/nalD敲除则减少PYO产生。

这项研究首次系统阐明了PYO通过双重机制调控MexAB-OprM外排泵：一方面直接结合抑制因子MexR和NaID解除其对mexAB-oprM的阻遏；另一方面通过激活因子BrlR(此前已报道)增强表达。同时发现NaID的双重角色——既是外排泵的抑制因子，又是吩嗪合成的激活因子，这种精巧设计使细菌能根据PYO浓度动态平衡毒力与耐药。

该研究的创新性在于揭示了细菌如何利用同一种代谢产物(PYO)通过浓度依赖的多靶点调控实现生理功能的精确协调。从应用角度看，阐明的PYO结合位点为设计新型抑制剂提供了分子靶点，而揭示的调控网络则提示同时靶向毒力和耐药通路可能是对抗铜绿假单胞菌感染的新策略。这些发现不仅深化了对RND外排泵调控机制的理解，也为开发抗耐药菌药物提供了重要理论基础。