致病性大肠杆菌中T6SS免疫蛋白RhsFI被重新利用调控小RNA的新机制

本研究揭示了致病性大肠杆菌(EHEC)中T6SS免疫蛋白RhsFI通过内部启动子表达，与毒素亚基RhsFint形成异源二聚体，调控Hfq/ProQ依赖性小RNA(sRNA)网络的新机制。研究人员通过TRAPP技术鉴定443种RNA结合蛋白，发现RhsFI能双向调节sRNA稳定性，影响酸耐受、黏附等毒力表型，为细菌适应性进化中" moonlighting蛋白"的功能重塑提供了范例。

　　

在细菌与宿主的军备竞赛中，病原体不断进化出精妙的基因调控网络。肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7作为重要食源性病原体，其致病岛编码的毒力因子表达受到多层次调控。虽然RNA伴侣蛋白Hfq和ProQ的作用已被广泛认知，但近期研究发现，一些"兼职蛋白"(moonlighting protein)可能通过意想不到的方式参与基因调控。其中，VI型分泌系统(T6SS)的效应蛋白-免疫蛋白对通常被认为仅参与细菌间竞争，但它们在胞内是否具有其他功能仍是未解之谜。

澳大利亚新南威尔士大学(UNSW Sydney)生物技术与生物分子科学学院的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究，揭开了T6SS免疫蛋白RhsFI的"双重身份"。通过系统性研究，发现该蛋白不仅能中和同源毒素活性，更能作为RNA结合蛋白(RBP)调控sRNA网络，直接影响细菌毒力。这一发现为理解细菌调控网络的复杂性提供了新视角。

研究采用TRAPP技术全面鉴定EHEC的RNA结合蛋白组，结合CRAC测序精确定位RhsFI的RNA结合位点，通过Alphafold2结构预测揭示RNA结合界面，并利用RNA-seq和表型分析验证功能影响。关键实验还包括PNK标记验证RNA结合活性、滤膜结合实验测定结合亲和力、以及牛肺细胞黏附实验等。

主要研究发现：

1. 病原岛编码的新型RNA结合蛋白

   通过TRAPP技术从EHEC中鉴定出443种RNA相关蛋白，其中35种位于致病岛。PNK实验证实ECs0604（后命名为RhsFI）具有RNA结合活性，在MEM-HEPES培养基中结合信号最强。

2. T6SS免疫蛋白的sRNA调控功能

   CRAC测序显示RhsFI偏好结合3'UTR来源的sRNA（如malM 3'UTR、RaiZ等），41.2%结合位点与Hfq重叠。滤膜结合实验测得RhsFI对malM 3'UTR的K_d=90.8 nM，虽弱于Hfq但具有特异性。

3. 内部启动子驱动的双功能模块

   RNA-seq发现rhsF基因内部存在独立启动子，可表达截短型毒素RhsF_int和下游RhsFI。Alphafold预测显示RhsF_int具有核酸酶结构域，与RhsFI形成的异源二聚体扩展了正电荷RNA结合表面。

4. 全局性基因表达调控

   △rhsF△rhsFI突变导致89个基因差异表达，涉及酸耐受（gadE下调2.3倍）、麦芽糖转运（malK上调4.1倍）等通路。Northern印迹证实RhsFI对sRNA的差异化调控：稳定ProQ靶标（如RaiZ），而 destabilize Hfq靶标（如GadY）。

5. 毒力表型影响

   突变株对牛肺细胞（EBL）的黏附能力降低34.3倍，酸耐受性增强；回补rhsF_int-rhsFI后表型恢复。共聚焦显微镜显示突变株细胞缩短，而过表达株出现丝状化。

这项研究首次揭示T6SS免疫蛋白被"重新利用"(repurposed)为sRNA调控因子的进化创新。其意义在于：

1. 拓展了对"兼职蛋白"功能多样性的认知，证明毒素-免疫蛋白对可进化出调控功能

2. 揭示3'UTR sRNA网络的复杂调控层级，Hfq/ProQ/RhsFI形成交叉调控网络

3. 为EHEC环境适应提供新解释，RhsF_int-RhsFI通过sRNA协调代谢与毒力基因表达

4. 结构预测显示β折叠片与α螺旋形成的新型RNA结合域，为人工设计RNA调控工具提供模板

该发现不仅深化了对细菌sRNA调控网络的理解，也为针对RNA-蛋白质相互作用的抗菌策略开发提供了新靶点。正如研究者所述："水平获得性RBP可快速重塑调控网络以促进毒力"，这一机制可能在病原体适应性进化中具有普遍意义。