综述：微生物聚羟基脂肪酸酯定量分析的最先进方法

这篇综述系统梳理了微生物聚羟基脂肪酸酯（PHA）定量分析的前沿技术，涵盖色谱法（GC-MS/Py-GC/MS/HPLC/LC-MS）和光谱法（FTIR/NMR/荧光检测），对比了各方法的灵敏度、通量及适用场景，为生物塑料研发提供了方法学指南。

　　

微生物聚羟基脂肪酸酯的定量技术全景

引言

聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一类由微生物合成的可降解聚酯，作为碳源和能量储存物质存在于细胞内。根据单体碳原子数可分为短链（scl-PHA，3-5个碳）、中链（mcl-PHA，6-14个碳）和长链PHA。其结构多样性和生物相容性使其在环保材料、生物医学和工业领域备受关注。准确量化PHA对优化生产流程、理解微生物生理至关重要。

PHA提取方法

提取分为溶剂法和无溶剂法。氯仿是溶剂法的标杆，但卤代溶剂对环境和操作者有害。新兴绿色溶剂（如碳酸二甲酯）和超临界流体提取技术正在发展。无溶剂法（如高压均质化、酶解法）虽更安全，但回收率和纯度较低。需注意提取方法会显著影响PHA结晶度、分子量和下游定量结果。

色谱定量技术

气相色谱-质谱联用（GC-MS）

1978年建立的GC-FID仍是金标准，通过酸性甲醇裂解细胞、氯仿提取、甲基化转化单体后检测，灵敏度达10^?5 g/L。但预处理耗时>30小时，需优化色谱柱（如HP-5非极性柱）和检测器（FID对烃类灵敏度达10^?12 g）。

热裂解-GC/MS（Py-GC/MS）

将干燥菌体与四甲基氢氧化铵（TMAH）混合，在400°C-600°C裂解后直接进样，仅需10-100 μg生物量，30分钟完成分析。与GC结果高度相关（R²>0.9766），但可能因TMAH高效反应轻微高估含量。

高效液相色谱（HPLC）

适用于非挥发性PHA检测，如碱法提取后衍生为2-丁烯酸（2BE），紫外检测限0.02 g/L。结合高压均质化提取可实现>88%回收率，但运行成本较高。

液相色谱-质谱（LC-MS）

通过检测巴豆酸（m/z=87）定量，灵敏度达1 ppm，优于GC，适合小体积培养（<15 mL），但设备维护复杂。

光谱定量技术

傅里叶变换红外光谱（FTIR）

通过酯羰基特征峰（1,728-1,744 cm^?1）半定量，需GC校准模型。最新研究显示其低估实际含量47%-94%，可能因提取效率不足。

核磁共振（NMR）

¹H NMR定量，¹³C NMR解析单体组成。台式NMR实现38秒在线检测（R²>0.94），但样品需数十毫克且溶解性差。

荧光定量（PHA-FQ）

尼罗红、LipidGreen等染料结合流式细胞术，5分钟完成检测，通量高但易受膜脂干扰。机器学习辅助的二维荧光光谱可实现实时监测（误差4.0%）。

特殊PHA变体的考量

低分子量PHA（如调控离子通道的cPHA）需HPLC-蛋白质印迹联用分析，需注意与储存PHA分离。

结论

色谱法（尤其Py-GC/MS）在准确性和灵敏度上领先，而光谱法（如PHA-FQ）更适合高通量筛选。选择方法需权衡：

• 精度优先：色谱法（GC-MS/NMR）

• 速度优先：光谱法（FTIR/荧光）

• 组成解析：NMR或LC-MS

• 新兴探索：LC-MS和机器学习辅助荧光法潜力显著