基于土壤环境DNA（eDNA）的液滴数字PCR检测技术作为陆地哺乳动物监测的新工具

《Global Pediatrics》：Soil eDNA-based droplet digital PCR assay as a new monitoring tool for terrestrial mammals

本研究通过优化ddPCR方法，利用靶向mtDNA cyt b基因的特异性引物和探针，首次实现了从土壤环境DNA中检测欧洲小盲鼠的五个隐种，灵敏度为0.073-236 copies/μL，验证了该方法在非入侵性监测中的有效性。

　　本研究展示了利用数字滴定PCR（ddPCR）技术从土壤来源的环境DNA（eDNA）中识别脊椎动物类群的可行性，这一方法尚未在文献中被详细记录。研究重点是检测一种名为“小盲鼹鼠”（BMR）的隐秘物种。实验中收集了来自塞尔维亚12个地点的38个土壤样本，涉及五种隐秘的BMR物种。研究人员基于线粒体细胞色素b（cyt b）基因设计了针对每种隐秘物种的特异性引物和探针组合，并通过优化ddPCR实验条件及验证引物与探针的特异性，确保了实验的准确性。所有样本均进行了三次重复实验，并使用RStudio v4.3.3环境对结果进行统计分析。实验结果显示，33个样本中发现了阳性结果，占总样本的86.84%，突显了ddPCR在检测和量化土壤中稀有且降解的DNA方面的强大能力。DNA浓度范围从0.073到236 copies/μL，显示出该技术在环境样本中的高度灵敏性。尽管引物和探针在区分两个亲缘关系最近的隐秘物种方面存在挑战，但通过荧光信号的差异，研究人员成功地提高了检测的准确性。这一方法为非侵入性监测提供了快速且高效的手段，适用于广泛区域的多种地点，为保护管理提供了必要的数据支持。此外，该协议还为其他受关注的陆地脊椎动物的保护策略提供了有价值的框架，特别是那些受到严格保护或被列为濒危物种的动物。

### 1. 引言

生物多样性的丧失不仅减少了物种数量、种群和生态系统，还削弱了遗传多样性，这对物种的适应能力及其长期生存至关重要。随着动物种群数量的减少，这些物种更容易受到遗传多样性下降和近亲繁殖衰退的影响，因此遗传监测在保护工作中发挥着关键作用。对于这类敏感、濒危或具有特殊生活习性的物种，非侵入性采样方法是理想的，因为它能降低对动物的威胁，同时使研究人员更容易和更安全地进行采样。非侵入性DNA分析已经成功应用于广泛动物类群，包括软体动物、两栖动物、鸟类、啮齿类和食肉动物。随着新技术的发展，如优化的协议，其有效性和性能将持续提升。在脊椎动物中，这种方法涉及收集如毛发、粪便、尿液、羽毛或脱落皮肤等样本，以及环境DNA（eDNA）。

### 1.1 非侵入性方法 – eDNA

个体在自然环境中进行日常活动时会脱落的遗传物质，如土壤、沉积物、水体、冰层甚至空气中，都可以被收集并提取为eDNA，即核DNA、叶绿体DNA和线粒体DNA。环境DNA可以反映现存植物和动物的生物多样性，包括数量和种类，从而为检测和识别稀有、隐秘或易受威胁的物种提供非侵入性、快速且经济有效的途径。尽管eDNA被视为现代生态学中的创新方法，但其应用可以追溯到1980年代中期，当时Ogram等人使用eDNA来识别海洋沉积物中的细菌群落。Willerslev等人在2003年进一步扩展了eDNA的方法学范围，将其应用于温带沉积物和冰芯样本中宏生物多样性的表征。虽然这些研究并非严格意义上的土壤分析，但它们为从陆地基质中提取古代DNA奠定了基础。

最初，eDNA主要通过元条形码分析来评估整个生物群落（Taberlet等人，2012）。然而，eDNA的应用范围迅速扩大，包括对土壤中eDNA的检测以及大规模生物多样性数据的收集。尽管元条形码方法在全面筛查所有存在的生物方面表现出色，但另一种用于eDNA分析的靶向方法，使用针对特定分类群设计的引物，提供了更高的灵敏度。Ficetola等人在2008年率先利用eDNA对水生宏生物进行物种特异性检测，证明了短的线粒体片段能够可靠地揭示难以捕捉的物种，如Rana catesbeiana。利用定量PCR（qPCR）进行eDNA物种检测已被证明非常成功，从而在水生和陆生环境中广泛用于监测受威胁、入侵或被过度利用的物种（Hernandez等人，2020；Leempoel等人，2020；Kyle等人，2022；Allen等人，2023）。比较元条形码与qPCR在eDNA分析中的研究建议，靶向方法是首选的分析手段（Wood等人，2019；Allen等人，2023；Serrao等人，2021）。随着eDNA分析方法的不断进步，ddPCR等新技术的应用正在不断拓展。

### 1.2 数字滴定PCR

数字滴定PCR（ddPCR）是一种强大的技术，用于检测和量化低浓度的DNA，通过将PCR反应分为超过20000个液滴，利用油性乳液（Doi等人，2015）。大多数研究认为，ddPCR在检测环境中低丰度的稀有物种方面比qPCR更敏感。此外，ddPCR对PCR抑制剂具有更高的耐受性，如土壤、水和食物中存在的物质，以及它允许在不依赖标准曲线的情况下进行DNA的绝对定量（Hunter等人，2019）。目前，ddPCR在水生生态系统中的eDNA研究更为常见，已被广泛用于濒危和入侵物种的生物多样性监测、鱼类种群数量估计、水质评估等。相比之下，关于ddPCR在土壤eDNA分析中的研究仍较为有限。

### 1.3 土壤eDNA分析的挑战

尽管ddPCR在检测低浓度DNA方面非常有效，但土壤eDNA分析的协议仍在发展，并且在某些情况下适用性有限，如检测植物寄生线虫、固碳微生物和植物病原真菌等（Lawaju和Yan，2024；Le Geay等人，2024；Liu等人，2020；Wang等人，2023）。其局限性主要源于从土壤中提取的DNA通常需要经过复杂的纯化过程，以克服各种成分对DNA保留和提取效率的影响。此外，腐殖酸残留会强烈抑制酶，如Taq聚合酶。尽管存在这些挑战，许多商业土壤DNA提取试剂盒已经能够从问题样本中获得满意的DNA量。

目前，关于使用土壤eDNA检测脊椎动物物种的研究主要集中在元条形码和qPCR方法上（Serrao等人，2021；Allen等人，2023；Mynhardt等人，2024）。因此，本研究代表了首次尝试使用高灵敏度的ddPCR方法检测脊椎动物物种，特别是陆地哺乳动物。

### 1.4 欧洲小盲鼹鼠的隐秘物种

我们采用ddPCR方法分析eDNA，以检测来自亚科Spalacinae的小盲鼹鼠（BMR）隐秘物种。这些鼹鼠是独居且领地性的地下哺乳动物，它们完全生活在自己挖掘的地下隧道系统中，主要以根、块茎、根茎、草等为食。BMR代表了开发从土壤中进行物种特异性检测协议的理想模型，因为它们在挖掘过程中会留下许多生物痕迹，如唾液、黏液、表皮细胞、尿液和粪便等。欧洲小盲鼹鼠的“Nannospalax leucodon”超种，原本分布广泛，但现在由于人类活动的影响，其分布范围大幅减少。此外，该超种的物种数量尚未完全明确，且大多数国家缺乏专门的保护计划。根据现有资料，该超种共有25种不同的染色体形式，其中7种被确认为生殖隔离且遗传分化明显的隐秘物种。这些物种的种群数量正在下降，其中5种在塞尔维亚被发现。根据最新研究，后两种隐秘物种可能面临严重的生存威胁，因此需要详细监测。由于这些严格受保护的动物捕捉过程缓慢且可能带来危险，且非致命采样无法在不给动物带来压力的情况下进行，因此迫切需要开发非侵入性采样方法，以探索其生物多样性并提出进一步的保护措施。

### 2. 方法

#### 2.1 土壤样本采集

本研究中分析的所有eDNA样本均来自2024年从塞尔维亚12个地点采集的38个土壤样本（表S1；图1a）。这些地点已被描述为含有隐秘物种的地点，通过cyt b和16S基因DNA条形码进行验证。这些样本的基因组DNA（gDNA）在2014年至2024年间被收集，作为ddPCR实验的阳性对照。对于8个土壤样本，我们有来自同一隧道系统的动物gDNA（表S1）。

我们采集了两种类型的土壤样本：34个来自野外动物地下隧道的样本，以及4个来自饲养笼的样本，这些动物在返回原隧道系统前被饲养了2至3天。为了选择活跃的BMR隧道系统，我们根据现场的土壤堆积情况，即近期动物活动的迹象进行选择。对于土壤采集，我们选择了带有新鲜鼻/牙齿痕迹和其他生物痕迹的隧道墙壁（图1b）。我们使用无菌刮刀轻轻刮取一层薄土，并从每个隧道系统中采集2至3个样本。土壤样本储存在2 mL的试管中，置于冰上，随后存放在-20°C环境中直至提取。

#### 2.2 eDNA提取

我们遵循标准的实验室协议以避免污染，包括在层流柜中操作、使用过滤吸管、提取空白等。在解冻后，每个土壤样本测量0.25 g用于eDNA提取，使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen，德国），并按照制造商的协议进行操作，但进行了一些小的修改，例如分两次加入洗脱缓冲液（Solution C6 – 10 mM Tris），并使用双倍体积以尽可能多地收集eDNA。所有eDNA提取完成后，使用Concentrator plus（Eppendorf AG，德国）将体积蒸发至20 μL，以获得足够的量用于ddPCR优化。所有DNA提取均储存在-20°C环境中。DNA浓度和质量通过NanoPhotometer N60（Implen GmbH，德国）进行测量。阳性对照即动物的gDNA样本被调整至10 ng/μL的浓度。

#### 2.3 引物和分子探针设计

我们设计了针对每种隐秘物种的特异性引物和探针，以开发ddPCR实验（hungaricus、montanoserbicus、montanosyrmiensis、serbicus和syrmiensis），以区分五种N. leucodon隐秘物种。设计基于77个N. leucodon的cyt b基因序列，这些序列来自塞尔维亚样本，而不考虑其他国家的相同隐秘物种的公开序列。序列通过MAFFT v7.520（Katoh和Standley，2013）对齐，并使用DECIPHER v2.26.0 R包（Wright等人，2012）进行可视化。设计的寡核苷酸通过Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer（RRID:SCR_001363）检查了潜在的二聚体和发夹结构。此外，获得的扩增子通过RestrictionMapper（https://www.restrictionmapper.org/）进行计算机模拟分析，以确保它们不会被EcoRI切割。水解探针使用5'端的6-FAM或HEX荧光标记和3'端的Black Hole Quencher（BHQ1）。所有引物和探针均通过Primer-BLAST（Ye等人，2012）进行计算机模拟的交叉扩增测试。寡核苷酸由Macrogen Europe（荷兰）合成。对于可能共存或重叠的隐秘物种（如hungaricus/syrmiensis、hungaricus/montanosyrmiensis、montanoserbicus/syrmiensis、montanoserbicus/serbicus），我们选择了不同的荧光标记，以便在需要时进行双标记反应。

#### 2.4 ddPCR实验优化

设计的引物和探针被用于开发五种单复式ddPCR实验，用于定性分析，即通过eDNA检测来确定隐秘BMR物种在研究地点的存在与否。实验通过改变多个条件，包括退火温度（Ta）、升温速率和循环次数，以在正负液滴之间生成最佳分辨率，并最小化“雨”效应（Lehman等人，2020；Kokkoris等人，2021）和阳性对照的浓度。

每个ddPCR反应的最终体积为20 μL，包括：1× ddPCR探针超级混合物（无dUTP）（Bio-Rad，美国）、600 nM的每种引物和探针、0.25 U/μL的EcoRI（Sigma Aldrich，美国）和3 μL未稀释的eDNA。此外，对于每种实验，测试了不同浓度的阳性对照（从0.2 ng/μL到0.1 ng/μL的gDNA）。因此，每种实验中加入了1 μL的gDNA作为阳性对照，或3 μL的水作为无模板对照（NTC）。

反应在以下热条件下进行：酶激活95°C 10分钟，随后是35至45次循环，每次循环包括95°C 0.5分钟的变性、54至62°C 1分钟的退火/延伸（退火温度根据实验不同而变化），最后是98°C 10分钟的酶失活。所有ddPCR反应均在QX200? Droplet Digital PCR System（Bio-Rad，美国）上进行，按照制造商的说明操作。DNA拷贝数的绝对定量通过QX Manager 1.2 Standard Edition软件（Bio-Rad，美国）计算。设置的截止值为每个样本反应中10000个液滴，表示接受的最小液滴数，即事件数。正负液滴的基线阈值根据NTC孔中的负液滴分布手动选择（Marques等人，2024）（图2）。此外，当负液滴的荧光信号幅度在样本之间变化时，必须调整每个样本反应的阈值。每个样本反应（eDNA、gDNA或NTC）的定量结果以每微升的DNA拷贝数表示。每种ddPCR实验中，所有样本反应、阳性对照（目标隐秘物种的gDNA）和NTC均进行了三次重复测试。需要三个重复以确认正液滴出现的可重复性，确保实验结果的可靠性和显著性。

#### 2.5 数据分析

统计分析和校正因子的计算在R软件v4.3.3（R Core Team，2021）和RStudio v4.3.3（RStudio Team，2020）中进行。ddPCR实验的扩增结果通过每种样本的三个重复中的正液滴数量进行分析，即样本重复之间的PCR一致性通过R包rptR v0.9.22（Stoffel等人，2017）进行评估。我们使用泊松分布来建模每种样本的三个重复中的正液滴平均数量。此外，使用绝对定量还计算了目标DNA的平均浓度（每微升的拷贝数）、正液滴的平均荧光强度以及每种隐秘物种实验的平均阈值荧光（图2）。由于样本之间负液滴的荧光信号幅度存在差异，对每个样本反应调整阈值是必要的。每种样本反应（eDNA、gDNA或NTC）的定量结果以每微升的DNA拷贝数表示。每种ddPCR实验中，所有样本反应、阳性对照（目标隐秘物种的gDNA）和NTC均进行了三次重复测试。需要三个重复以确认正液滴出现的可重复性，确保实验结果的可靠性和显著性。

### 3. 结果

所有eDNA样本均具有高纯度，如260/280和260/230的比值显示了极低的污染水平，表明在蒸发步骤前，DNA浓度介于20至200 ng/μL之间。五种实验被开发用于区分N. leucodon的五种隐秘物种，目标为线粒体DNA（mtDNA）的cyt b基因区域，每个实验的扩增子长度范围从145至235 bp。由于隐秘物种之间的序列相似性，引物和探针的设计面临挑战。例如，hungaricus、montanoserbicus和montanosyrmiensis的引物和探针仅在目标序列中具有结合能力，其中15/15、6/9（由于序列覆盖不足）和21/25（由于缺乏覆盖或引物5’端存在一个错配）分别对应。serbicus的引物结合了13/15的目标序列，但由于该隐秘物种的序列特征，设计的引物和探针与其他隐秘物种的错配较少，这需要进行严格的实验优化。syrmiensis的引物结合了4/13的目标序列，主要由于探针和反向引物区域的一些序列覆盖不足。每个实验的引物和探针结合位点及其与其他非目标隐秘物种的错配情况如图S1所示。

### 3.2 ddPCR实验的优化条件

每种引物/探针组合的优化退火温度（Ta）在表1和图2中列出。基因组DNA和环境DNA均被纳入优化过程。影响选择最佳Ta的因素包括：1）正负液滴云之间的最大分辨率；2）“雨”效应（正液滴的低荧光幅度）的最小化；3）正液滴的荧光幅度在gDNA阳性对照和eDNA样本之间的一致性，如图2所示的1D荧光信号幅度图。通过增加ddPCR循环次数（从35次增加到45次），可以达到更多的正液滴。当使用0.1 ng/μL的gDNA阳性对照时，正液滴与gDNA样本之间的最佳一致性被实现。优化后的实验条件通过手动选择每个隐秘物种实验的基线阈值，基于NTC孔中负液滴的分布（Marques等人，2024）（图2）。此外，当不同样本的负液滴荧光信号幅度存在差异时，必须对每个样本反应进行阈值调整。每种样本反应（eDNA、gDNA或NTC）的定量结果以每微升的DNA拷贝数表示。每种ddPCR实验中，所有样本反应、阳性对照（目标隐秘物种的gDNA）和NTC均进行了三次重复测试。需要三个重复以确认正液滴出现的可重复性，确保实验结果的可靠性和显著性。

### 3.3 ddPCR实验结果的解释

我们主要进行了定性评估，以识别在塞尔维亚分布的五种隐秘物种，旨在建立一种快速且非侵入性的监测方法，以明确它们的分布范围，从而支持保护工作。尽管定量分析不是本研究的主要目标，但它对于定义目标DNA的浓度以与空白极限（LoB）进行比较，从而区分正向和假正/负结果是必要的。环境DNA仅包含极少量的目标DNA，因此一个显著的正液滴即可确认目标物种。Liu等人（2020）检测到土壤样本中真菌植物病原体的浓度低至2.1 copies/mL，而Wang等人（2023）发现的真菌DNA浓度范围为0.2至7.5 copies/μL。Lawaju和Yan（2024）量化了土壤eDNA中线虫DNA的浓度范围为1.89至275.42 copies/μL，与我们的结果相似。在这里获得的浓度值范围从0.073到236 copies/μL，这可能归因于不同的土壤类型、目标DNA在土壤中的分布不均以及采样过程中的随机效应。

为了区分正负液滴，我们根据NTC孔中负液滴的分布手动选择了每个隐秘物种实验的基线阈值，如Marques等人（2024）所述。然而，由于样本之间负液滴的荧光信号幅度存在差异，我们确认了对每个样本反应调整阈值的必要性（Porco等人，2022）。一些样本中正液滴的最小数量，如我们实验中的结果，已在先前研究中被报道（Capo等人，2021）。当目标DNA的量极其低时，且阈值基于NTC孔中负液滴的分布，某些非特异性扩增可能被误认为正向结果（Kokkoris等人，2021）。这可能是由于外来颗粒或仪器相关误差（Kiselinova等人，2014；Yang等人，2014；Hunter等人，2019）。例如，Tournayre等人（2023）在两个重复的子样本中仅检测到一个正液滴，突显了检测稀有DNA目标的挑战。

我们的结果包括三个eDNA样本，其目标DNA的平均数量低于计算的LoB值，因此需要进一步进行重复性测试。其中两个样本（10_1和13_1）包含少量正液滴，这些正液滴的荧光幅度与阳性对照的范围相符，但仅在三个重复中的一个中出现，因此被归类为假阳性。然而，一个样本（13_2）在两个重复中产生了可重复的正液滴，并在独立运行中得到确认，表明信号具有真实的生物学基础，因此被归类为阳性。因此，我们强调初步结果（本研究中35个样本中有至少一个正向重复，即92.11%的成功率）需要进一步测试，以达到可靠的结果（38个土壤eDNA样本中有33个为阳性，即86.84%的阳性发现）。

### 4. 讨论

#### 4.1 ddPCR在减少抑制效应中的优势

本研究展示了利用土壤来源的环境DNA（eDNA）和数字滴定PCR（ddPCR）技术检测和识别脊椎动物类群的先进方法。与传统的元条形码和定量PCR（qPCR）方法相比，ddPCR在检测环境中低丰度的稀有物种方面具有关键优势，包括更高的对PCR抑制剂的耐受性（Dingle等人，2013；Doi等人，2015；Capo等人，2021），增强的灵敏度和精确度（Mauvisseau等人，2019；Wood等人，2019；Marques等人，2024），以及在不依赖标准曲线的情况下进行DNA的绝对定量（Hunter等人，2019）。目前，ddPCR在水生生态系统中的eDNA研究更为常见，已被广泛用于濒危和入侵物种的生物多样性监测、鱼类种群数量估计、水质评估等。相比之下，关于ddPCR在土壤eDNA分析中的研究仍较为有限。

#### 4.2 土壤eDNA采样设计

采样设计是eDNA研究中的关键第一步，需要仔细考虑影响eDNA信号检测和浓度的各种参数（Goldberg等人，2016）。这些参数因环境而异。在河流系统中，eDNA通常存在于较低浓度，需要特殊的过滤技术来捕捉足够的遗传物质进行分析，但下游的eDNA迁移扩展了可以捕捉遗传物质的区域，使水生环境成为监测物种的理想选择（Shogren等人，2017；Carraro等人，2018；Pont等人，2018）。与水生环境不同，土壤eDNA主要局限于原地沉积的遗传物质，因此其检测范围显著受限。尽管这种空间限制可能看起来是一个劣势，但它为研究人员提供了对采样地点的精确控制，使得在更广泛的景观中进行高度针对性的研究成为可能（Allen等人，2023）。因此，采样设计应根据目标物种的具体生物学特性进行优化，以集中生物痕迹并提高采样成功率。地下或挖掘动物（如盲鼹鼠、鼹鼠、地 squirrel、掘穴爬行动物）由于与土壤的长期接触，具有较高的采样成功率。此外，具有嗅觉标记或挖掘行为的领地哺乳动物（如獾、狐狸）或具有可预测的休息或筑巢地点（如洞穴下方、巢穴或习惯性休息地点）的物种也是土壤eDNA筛选的理想对象。未来应用可能在多个分类群和生态背景下彻底改变生物多样性评估实践。

#### 4.3 ddPCR结果的解释

我们主要进行了定性评估，以识别在塞尔维亚分布的五种隐秘物种，旨在建立一种快速且非侵入性的监测方法，以明确它们的分布范围，从而支持保护工作。尽管定量分析不是本研究的主要目标，但它对于定义目标DNA的浓度以与空白极限（LoB）进行比较，从而区分正向和假正/负结果是必要的。环境DNA中仅含有极少量的目标DNA，因此一个显著的正液滴即可确认目标物种。例如，Liu等人（2020）检测到土壤样本中真菌植物病原体的浓度低至2.1 copies/mL，而Wang等人（2023）发现的真菌DNA浓度范围为0.2至7.5 copies/μL。Lawaju和Yan（2024）量化了土壤eDNA中线虫DNA的浓度范围为1.89至275.42 copies/μL，这与我们的结果相似。在这里获得的浓度值范围从0.073到236 copies/μL，这可能归因于不同的土壤类型、目标DNA在土壤中的分布不均以及采样过程中的随机效应。

为了区分正负液滴，我们根据NTC孔中负液滴的分布手动选择了每个隐秘物种实验的基线阈值（Marques等人，2024）。然而，由于样本之间负液滴的荧光信号幅度存在差异，我们确认了对每个样本反应调整阈值的必要性（Porco等人，2022）。一些样本中正液滴的最小数量，如我们实验中的结果，已在先前研究中被报道（Capo等人，2021）。当目标DNA的量极其低时，且阈值基于NTC孔中负液滴的分布，某些非特异性扩增可能被误认为正向结果（Kokkoris等人，2021）。这可能是由于外来颗粒或仪器相关误差（Kiselinova等人，2014；Yang等人，2014；Hunter等人，2019）。例如，Tournayre等人（2023）在两个重复的子样本中仅检测到一个正液滴，突显了检测稀有DNA目标的挑战。

我们的结果包括三个eDNA样本，其目标DNA的平均数量低于计算的LoB值，因此需要进一步进行重复性测试。其中两个样本（10_1和13_1）包含少量正液滴，这些正液滴的荧光幅度与阳性对照的范围相符，但仅在三个重复中的一个中出现，因此被归类为假阳性。然而，一个样本（13_2）在两个重复中产生了可重复的正液滴，并在独立运行中得到确认，表明信号具有真实的生物学基础，因此被归类为阳性。因此，我们强调初步结果（本研究中35个样本中有至少一个正向重复，即92.11%的成功率）需要进一步测试，以达到可靠的结果（38个土壤eDNA样本中有33个为阳性，即86.84%的阳性发现）。

#### 4.4 重复性评估概述

基于rptR的分析显示，正液滴在不同重复中的出现具有高度一致性，这支持了实验的可靠性，大部分观察到的变异归因于样本之间的差异（即生物和采样技术因素），而非随机噪声。两种模型（Org和Link）的置信区间相对较窄，进一步增强了估计的可靠性，其中Link模型的估计更为稳定。广义线性混合模型更好地描述了ddPCR数据的泊松分布性质，并提供了精确的重复性估计。Link模型的重复性比Org模型更高，表明对正液滴数量的对数转换提高了对变异的检测能力。低p值（0.005对于Org和0.004对于Link）表明观察到的重复性具有强烈的统计支持，并确认这些结果不太可能是随机变异的结果。

#### 4.5 BMR引物/探针集的特异性

针对三种隐秘BMR物种设计和优化的引物/探针集在交叉物种测试中表现出高特异性，即只有目标gDNA样本被扩增，而其他四种隐秘物种的gDNA样本为阴性。然而，区分N. l. serbicus和N. l. syrmiensis存在困难，这符合它们亲缘关系最近的预期。设计的引物和探针与非目标隐秘物种之间存在少量错配。在N. l. syrmiensis的交叉物种测试中，当使用N. l. serbicus和N. l. hungaricus的gDNA样本时，产生了非特异性正向液滴，但根据荧光信号幅度的差异，可以区分隐秘物种。具体而言，N. l. syrmiensis的特异性正向液滴的荧光幅度约为7000，而非特异性正向液滴的荧光幅度分别为N. l. serbicus约4500和N. l. hungaricus约3000。因此，可以通过将阈值线设置得更高，从而提高实验的特异性。最终，我们成功利用五种设计的引物/探针集区分了所有隐秘物种，除了两个有问题的N. l. serbicus和N. l. syrmiensis。然而，这些两个隐秘物种在野外不会重叠，因为它们的分布区域自然被多瑙河分隔（Savi?和Soldatovi?，1984）。尽管如此，未来的研究可能需要开发新的引物/探针集，以针对不同的线粒体基因，从而区分这两个隐秘物种。

尽管N. leucodon超种在它们的分布范围内存在广泛的种内遗传变异，但从塞尔维亚种群开发的引物和探针在所有测试物种中表现出令人满意的可靠性，值得进一步验证。这为其他地区的保护工作提供了重要支持。

#### 4.6 BMR隐秘物种与生物多样性监测

隐秘物种往往通过分子技术而非传统的形态学检查被发现，并且在某些分类群（如昆虫、青蛙、蝙蝠等）和地理区域（如热带雨林和海洋栖息地）中占据了显著的多样性比例。同时，新的隐秘物种仍在不断被发现（Bickford等人，2007）。N. leucodon超种的遗传变异广泛，且表型变异较小（Savi?和Soldatovi?，1984），这使得它们在生物学上被标记为细胞型、种群或兄弟/近亲物种（Nevo等人，2001；Savi?等人，2017）。由于物种数量尚不确定，且大多数国家缺乏专门的保护计划，有效的保护策略难以实施。尽管N. leucodon超种在塞尔维亚被严格保护（Vasi?等人，1990），但其五个隐秘物种的自然栖息地由于广泛的城市化和入侵农业而大幅减少（Bugarski-Stanojevi?等人，2022；Bugarski-Stanojevi?等人，2024）。

生物多样性监测对于评估日益加剧的人类压力对自然生态系统的潜在影响至关重要，并且有助于制定和实施政策和管理措施（Pocock等人，2015；Wu等人，2017；Díaz等人，2019）。有效的和适当的监测方法对于保护大多数受威胁的物种和生态系统社区是必不可少的（Robinson等人，2018）。它们需要能够准确检测受保护物种或感兴趣物种，同时最小化采样努力、经济成本、死亡率和对受威胁物种的干扰（Scheele等人，2019）。从应用角度来看，环境管理者需要明确的指南来设计适当的生物监测项目，以最大化DNA方法在物种检测中的效果。

本研究展示了利用土壤eDNA进行ddPCR检测作为快速且高效的非侵入性监测工具，其灵敏度足以识别隐秘物种，为保护管理提供了必要的数据支持。ddPCR在检测和量化土壤中稀有或降解DNA方面的显著成果进一步证明了其在生物多样性监测中的潜力。这项开创性工作为将ddPCR技术应用于其他受关注的陆地脊椎动物的土壤eDNA分析奠定了方法学基础。采样设计应根据目标物种的具体生物学特性进行优化，以集中生物痕迹并提高采样成功率。地下或挖掘动物（如盲鼹鼠、鼹鼠、地 squirrel、掘穴爬行动物）由于与土壤的长期接触，具有较高的采样成功率。此外，具有嗅觉标记或挖掘行为的领地哺乳动物（如獾、狐狸）或具有可预测的休息或筑巢地点（如洞穴下方、巢穴或习惯性休息地点）的物种也是土壤eDNA筛选的理想对象。未来应用可能在多个分类群和生态背景下彻底改变生物多样性评估实践。