混合模式色谱与二维液相色谱-质谱联用技术增强寡核苷酸分离分析方法的开发与应用

这篇研究创新性地开发了基于反相-弱阴离子交换混合模式色谱（RP-WAX MMC）的寡核苷酸分析方法，通过结合电荷与疏水性双重分离机制，显著提升了分离效果并避免了离子对试剂的使用。研究进一步构建了二维液相色谱（2DLC）系统，利用HILIC型LUNA Omega Sugar柱实现磷酸盐缓冲液与寡核苷酸的高效分离，使质谱（MS）信号强度提升100倍，为复杂寡核苷酸杂质鉴定提供了高灵敏度解决方案。

　　

摘要

研究团队突破传统离子对反相色谱（IP-RPLC）的局限，开发了基于反相-弱阴离子交换混合模式色谱（RP-WAX MMC）的寡核苷酸分离技术。该方法通过pH梯度（7-8）和缓冲液浓度梯度（100-200 mM）调控选择性，结合30%乙腈（ACN）优化保留行为，成功分离了16聚体寡核苷酸及其降解产物（如脱嘌呤、短链杂质等）。为解决磷酸盐缓冲液与质谱（MS）的兼容性问题，团队设计多环路二维液相色谱（2DLC）系统，第二维采用HILIC型LUNA Omega Sugar柱，实现磷酸盐去除与目标物富集，使MS信号强度提升100倍。

1 引言

寡核苷酸作为基因治疗与生物技术的核心工具，其复杂结构和极性特性对分析方法提出挑战。传统IP-RPLC依赖离子对试剂，但会抑制MS信号。混合模式色谱（MMC）整合反相（RP）与离子交换（IEC）机制，为多属性杂质分析提供新思路。研究聚焦RP-WAX MMC柱的独特性能，通过烷基链末端三级胺的电荷调控，实现pH依赖性分离，同时探索2DLC-MS联用方案以突破缓冲液限制。

2 材料与方法

实验采用合成未纯化的16聚体寡核苷酸（序列：GGG AAA mCmCmC TTT GAmCT），通过Acclaim RP-WAX-1柱（3 μm）进行一维分离，优化参数包括温度（30°C）、ACN含量（15%-35%）及梯度条件。二维系统配备8种体积环路（5-250 μL），第二维采用LUNA Omega Sugar柱（3 μm），以水-ACN梯度（66.5%-19% ACN）实现脱盐。质谱采用Synapt G2S qTOF，负离子模式检测（m/z 500-2500）。

3 结果与讨论

3.1 一维RP-WAX MMC方法开发

RP-WAX柱在pH 7-8区间展现优异选择性，磷酸盐缓冲液为必需条件（乙酸/甲酸盐无法有效洗脱）。梯度优化显示，pH与浓度同步升高可分离不同长度杂质（如14聚体GGxA缺失型与17聚体+G型）。ACN含量影响保留机制平衡，20% ACN时脱嘌呤杂质（12.45 min）与短链（13.59 min）实现基线分离。

3.2 二维方法开发

HILIC柱（如BEH Amide）因进样溶剂效应导致峰变形，而LUNA Sugar柱通过极性相互作用实现磷酸盐与寡核苷酸分离。2DLC系统对主峰（24 min）进行心切割后，28 min处检测到浓缩目标物，但存在溶剂过载导致的峰分裂现象。质谱数据揭示多电荷离子簇（[M-3H]^3-至[M-8H]^8-），并鉴定出11种杂质（如5′-磷酸化降解产物k和脱碱基变异体i）。

4 结论

该研究建立的RP-WAX MMC/2DLC-UV-MS方法兼具高分辨率与MS兼容性，为寡核苷酸治疗药物的杂质谱分析提供标准化方案。未来可通过陷阱柱优化进一步提高二维分离效率。