基于牛津纳米孔技术的棘冠海星（Acanthaster cf. solaris）全基因组甲基化图谱解析及其在海洋无脊椎动物表观遗传进化中的意义

这篇研究首次利用牛津纳米孔技术（ONT）对珊瑚礁杀手——太平洋棘冠海星（CoTS）进行全基因组甲基化（5mC）分析，揭示了其37.7%的中等甲基化水平及典型的镶嵌模式（mosaic pattern）。研究通过优化高分子量DNA提取方案，覆盖90%以上CpG位点，发现甲基化主要富集于内含子区（48.4%-49.8%）和重复元件（较背景高12.7%），为后口无脊椎动物在表观遗传谱系中的过渡地位提供了新证据。该工作建立了非模式物种ONT甲基化分析的标准流程，为海洋生物环境适应机制和种群管理策略开发奠定基础。

　　

1 引言

DNA甲基化作为关键表观遗传机制，在调控基因表达和染色质结构中发挥核心作用。尽管在脊椎动物中研究广泛，但无脊椎动物尤其是后口无脊椎动物的甲基化模式仍知之甚少。本研究以破坏珊瑚礁生态的太平洋棘冠海星（Acanthaster cf. solaris）为对象，首次采用ONT V14化学技术进行全基因组甲基化分析，填补了这一演化关键节点物种的表观遗传空白。

2 材料与方法

2.1 样本制备

选取实验室培育的2龄期CoTS个体（n=3），通过 kinship分析确认其为半同胞关系（φ=0.12-0.15）。采用改良酚-氯仿法提取高分子量DNA，经0.4×SPRIselect磁珠筛选去除短片段，最终获得平均长度>2 kbp的DNA。

2.2 ONT测序

使用SQK-NBD114-24试剂盒构建文库，R10.4.1流动槽在MinION Mk1C平台进行72小时测序。通过Guppy v6.5.7进行SUP模型碱基识别，modbam文件包含5mC修饰位点信息，置信度阈值设为99.4%。

2.3 生物信息学分析

基于CoTS OKI-Apl_1.0参考基因组，使用methylKit分析甲基化水平。基因区定义为转录起始位点（TSS）上下游2 kb，重复元件通过基因组软掩膜区域识别。

3 结果

3.1 测序性能

三组测序共产生22.32 Gbp数据，平均读长2-2.7 kbp（N50 3-3.6 kbp），覆盖91.9%-96.1%的基因组CpG位点（深度>5×）。

3.2 甲基化景观

全基因组甲基化水平37.7%，呈现典型双峰分布：56% CpG完全未甲基化，34%高度甲基化（>80%）。Circos图显示甲基化与转座子密度、基因密度呈空间相关性。

3.3 甲基化靶点

• 基因体偏好性：65%甲基化位点位于内含子（平均48.4%-49.8%），26%位于外显子（44.1%-45.2%），启动子区仅占1%（4.9%-5.1%）

• 重复元件富集：内含子区重复元件甲基化水平（59.5%）显著高于背景（46.8%，p<2.2×10^-16）

• 进化比较：甲基化水平介于原口动物（如太平洋牡蛎21%）与脊椎动物（80%）之间，与玻璃海鞘（30%-40%）等后口无脊椎动物相似

4 讨论

技术突破：改良的DNA提取方案解决了海洋无脊椎动物高分子量DNA获取难题，ONT长读长特性克服了短读长测序对重复区域的组装偏差。

进化意义：CoTS中等甲基化水平支持"后口动物作为表观遗传过渡类群"假说，其基因体甲基化模式可能通过调控可变剪切（如内含子区甲基化影响剪接因子结合）增强环境适应性。

生态应用：重复元件的高甲基化暗示基因组防御机制，而甲基化可塑性可能与CoTS应对食物短缺等压力的能力相关。研究为开发表观遗传生物标志物（如年龄鉴定）提供了数据基础。

5 结论

该研究建立了ONT在非模式物种表观遗传研究中的标准化流程，揭示CoTS甲基化特征为理解后口动物表观遗传进化提供了新视角。未来可结合转录组分析，探究甲基化对珊瑚礁害虫环境适应力的调控机制。