单细胞转录组测序揭示鞘脂代谢通路在烟草叶片衰老中的关键调控作用

本研究通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术构建了烟草成熟期与衰老期叶片的单细胞转录图谱，首次在单细胞分辨率下解析了叶片衰老过程中鞘脂代谢通路(sphingolipid metabolism)的关键调控作用。研究人员鉴定出15个细胞簇并成功注释为10种细胞类型，发现衰老相关基因SAG12、SEN4等在栅栏组织、海绵组织等细胞中特异性表达。尤为重要的是，研究发现SPT(serine palmitoyltransferase)等鞘脂代谢通路基因在衰老叶片中显著上调，通过qRT-PCR验证了该通路的9个核心基因协同调控网络。该成果为理解植物器官衰老的细胞异质性提供了新视角，发表于《BMC Plant Biology》。

　　

烟草作为重要的经济作物和模式植物，其叶片衰老（黄化）过程直接影响采收时机和次生代谢物形成。然而，叶片衰老的细胞学过程及其调控机制仍不明确。传统转录组技术难以揭示细胞异质性，而单细胞测序在衰老组织研究中的应用又面临技术挑战——衰老组织存在光合效率减弱、活性分子降解等问题。更关键的是，虽然已有研究报道鞘脂代谢与植物衰老相关，但其在烟草叶片衰老中的细胞特异性调控机制仍是空白。

针对这些问题，重庆邮电大学生命健康信息科学与工程学院的研究人员联合中国农业科学院烟草研究所等机构，首次采用单细胞核RNA测序技术，构建了烟草成熟叶(ML)和衰老叶(SL)的高分辨率转录图谱。研究发现鞘脂代谢通路通过细胞特异性方式调控叶片衰老进程，相关成果发表在《BMC Plant Biology》上。

研究主要采用三大技术方法：1) 通过改良的细胞核分离方法从3月龄烟草的成熟和衰老叶片获取单细胞核；2) 使用10x Genomics平台构建文库并进行Illumina NovaSeq X Plus测序；3) 采用Seurat软件进行细胞聚类和差异表达分析，结合Monocle 2.0构建伪时间轨迹。样本来自烟草栽培种K326，设置成熟叶(完全展开的深绿色叶片)和衰老叶(第3-5节位的明显黄化叶片)两组。

单细胞图谱构建与细胞类型鉴定

研究获得17,100个高质量细胞，聚类为15个亚群。通过已知标记基因鉴定出10种细胞类型，包括栅栏组织细胞（高表达FBA2、RBCS）、海绵组织细胞（高表达BHLH96）、表皮细胞（高表达CUT1）等。值得注意的是，栅栏组织和海绵组织细胞合计占比达45%，是叶片的主要功能单元。

衰老相关差异表达基因

比较ML和SL发现，栅栏组织细胞中有5,400个差异基因（1,822个上调）。GO分析显示这些基因主要富集在"光合作用"和"叶绿体组织"等条目。引人注目的是，鞘脂代谢通路基因在多个细胞类型中显著上调，而大多数其他代谢通路基因呈下调趋势。

伪时间轨迹分析

通过SAG12、SEN4等已知衰老标记基因定位，发现衰老相关变化主要发生在栅栏组织、表皮等细胞中。伪时间分析鉴定出538个与衰老进程正相关的基因，包括12个WRKY家族成员和蔗糖合成酶SUS2，这些基因在"糖代谢"和"植物激素信号转导"通路中显著富集。

鞘脂代谢通路的核心作用

研究首次在单细胞层面揭示鞘脂代谢通路的激活模式：SPT（催化鞘氨醇合成的限速酶）在衰老叶片中上调2-4倍，其下游基因SUR2（鞘氨醇C4-单加氧酶）和SPHK1（鞘氨醇激酶1）在栅栏组织等细胞中协同上调。qRT-PCR验证显示，该通路的9个核心基因在衰老叶片中形成连贯的调控网络。

这项研究建立了首个烟草叶片衰老的单细胞图谱，揭示了鞘脂代谢通路通过细胞特异性方式调控衰老进程。该发现不仅为理解植物器官衰老的细胞异质性提供了新范式，更重要的是，SPT等关键基因的鉴定为通过分子育种调控烟草采收期提供了新靶点。研究采用的单细胞核测序策略，也为其他难以制备原生质体的衰老组织研究提供了技术参考。未来研究可进一步探索鞘脂代谢产物（如鞘氨醇-1-磷酸）如何与已知衰老信号通路（如乙烯信号）交互作用，从而更全面地解析叶片衰老的调控网络。