NOTCH3胞外域内吞脱落机制揭示CADASIL突变体异质性激活路径

本研究针对CADASIL（伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病）致病机制，通过构建NOTCH3突变体（R90C/C212Y/C455R），结合内吞示踪、双荧光标记和荧光素酶报告系统，揭示NOTCH3胞外域（ECD）通过基础内吞途径脱落的分子机制。研究发现不同突变体通过金属蛋白酶依赖/非依赖的异质性途径激活信号，为靶向调节内吞通路治疗小血管疾病提供新策略。

　　

脑血管疾病领域长期存在一个谜题：为何NOTCH3基因特定突变会导致CADASIL（伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病）？这种以血管平滑肌细胞（VSMCs）退化和胞外域（ECD）沉积为特征的疾病，其分子机制始终未明。传统观点认为突变导致NOTCH3蛋白错误折叠，但越来越多的证据表明信号通路异常和ECD毒性共同驱动疾病进展。

英国曼彻斯特大学生物科学学院的Samira Hosseini-Alghaderi和Martin Baron团队在《Cell Communication and Signaling》发表的研究，通过创新性地追踪NOTCH3内吞命运，揭示了ECD通过基础内吞途径脱落的分子机制。研究发现，不同于配体依赖的经典激活途径，CADASIL突变体通过内吞途径实现ECD脱落，且R90C突变表现出独特的TRPML依赖、金属蛋白酶非依赖的激活模式，这为理解疾病异质性提供了关键线索。

研究人员主要采用四大技术体系：①脉冲追踪内吞实验（使用hTERT-RPE1细胞系）；②双荧光蛋白标记NOTCH3（FP1/FP2构建体）；③免疫荧光共定位分析（结合EEA1/CD63/LAMP1等内吞标志物）；④荧光素酶报告系统（CBF-luciferase）量化信号活性。

细胞表面定位与内吞启动

通过AlphaFold2结构预测和免疫定位证实，R90C/C212Y/C455R突变体均能正常转运至细胞膜，且表面分布模式与野生型（WT）无显著差异。脉冲追踪实验显示，所有突变体均能在15-30分钟内被内化至EEA1⁺早期内体，颠覆了"突变导致ER滞留"的传统认知。

ECD/ICD分离的时空特征

双抗体标记和FP2-NOTCH3荧光示踪发现：在早期内体（EEA1⁺）中，WT主要呈现全长或ECD-only形式；而R90C突变体ICD-only斑点比例显著增加（p<0.05）。晚期内体（CD63⁺）和溶酶体（LAMP1⁺）则普遍存在ICD-only定位。这种差异提示R90C的ECD脱落可能发生在更早的内吞阶段。

信号激活的异质性机制

荧光素酶报告系统显示：R90C基础活性显著高于WT（p<0.05），且对金属蛋白酶抑制剂BB94不敏感，但对TRPML抑制剂ML-SI1高度敏感；而C455R/C212Y仍保持金属蛋白酶依赖性。这种机制转换与R90C特有的内吞定位特征相吻合。

内源性验证与病理关联

在hESC分化的VSMCs中重现了ECD/ICD分离现象。值得注意的是，金属蛋白酶抑制导致全长NOTCH3在晚期内体累积，证实ADAM10参与内吞途径的ECD清除。

这项研究建立了NOTCH3内吞脱落的理论框架：①基础内吞是ECD沉积的重要来源；②不同突变通过"分子分流"（molecular shunt）选择不同激活路径；③内吞调节网络可成为治疗靶点。特别是发现R90C（CADASIL高频突变）的TRPML依赖机制，为开发突变特异性疗法指明方向。研究还提出"内吞调谐"（endocytic tuning）概念，即通过调节TRPML或ESCRT等内吞元件精确控制NOTCH3活性，避免直接抑制Notch信号引发的严重副作用，这对慢性血管病变的治疗策略具有重要启示。

该成果不仅解释了CADASIL患者血管壁ECD沉积的细胞生物学基础，更为年龄相关性小血管病（SVD）的治疗提供新思路。研究者特别指出，内吞通路可能成为平衡NOTCH3功能"双刃剑"效应的关键节点——在维持血管稳态的同时，避免毒性ECD的长期累积。