肽自组装和水凝胶化过程中的电荷调控

《Journal of Colloid and Interface Science》：Charge regulation in peptide self-assembly and hydrogelation

pH响应肽KD自组装形成β-片纤维凝胶，通过NMR、Cryo-TEM和流变学证实pH漂移由His质子化调控，弹性模量随时间升高，缓冲溶液影响结构演化。

　　本研究围绕一种来源于人类精液凝固蛋白I（Semenogelin I）的短肽KD（Ac-KGSFSIQYTYHVD-CONH?），探讨其在不同pH条件下形成pH响应型水凝胶的机制。通过结合多种实验技术，如时间分辨核磁共振（NMR）、低温透射电子显微镜（Cryo-TEM）和流变学分析，研究团队揭示了KD肽在水环境中随时间变化的自组装过程及其对机械性能的影响。该研究不仅为理解pH响应型肽水凝胶的形成机制提供了新的视角，也为未来开发具有智能响应特性的生物材料奠定了理论基础。

KD肽在水溶液中表现出显著的pH响应特性。随着自组装过程的进行，其pH值会逐渐发生变化，这种变化与肽中可离子化残基的pKa值调节密切相关。在自组装过程中，自由的肽单体与形成纤维结构的肽之间发生质子交换，从而影响整个体系的pH水平。这种动态调节机制使得KD能够形成具有可调机械性能的水凝胶网络。在实验中，研究团队观察到，当KD在纯水中自组装时，其pH值从初始设定的8.7逐渐下降至7.4，并在24小时内稳定。相比之下，当起始pH为6.3时，pH值则上升至7.4。这种pH变化表明，自组装过程中肽的结构发生了显著改变，导致质子的释放或吸收，从而影响整个系统的电荷状态。

NMR实验进一步揭示了KD肽自组装过程中质子交换的动态特性。通过监测His残基的Hε1和Hδ2信号的变化，研究团队发现这些信号的化学位移随时间发生变化，并且信号宽度增加，表明质子交换过程在进行。在pH值接近其等电点（pI）时，His的pKa值会降低，这可能与纤维结构中His残基之间的相互作用有关。在较高的pH条件下，His的环状结构通常处于去质子化状态，有利于稳定的π-π堆积作用，而在较低的pH条件下，His的质子化状态会增加，从而导致电荷之间的排斥作用，影响纤维的稳定性。这一发现表明，His在KD自组装过程中扮演了关键角色，其质子化状态的变化直接影响肽的结构转变和机械性能的动态调整。

Cryo-TEM图像则提供了KD自组装过程中微观结构演变的直接证据。在自组装初期，KD溶液中同时存在长直纤维和螺旋状的扭曲结构。这些扭曲结构可能是在纤维形成过程中的中间态，随着自组装的进行，它们逐渐消失，取而代之的是更稳定的长直纤维网络。这种结构变化不仅反映了KD的自组装路径，还揭示了其在不同pH条件下的形貌差异。在缓冲液中，KD的自组装过程受到pH值的严格控制，其结构在较短时间内趋于稳定，而在纯水中，由于缺乏外部缓冲，pH值会随时间发生自然漂移，从而影响自组装的路径和最终形成的网络结构。

流变学研究进一步验证了KD水凝胶的机械性能随时间的变化。在小振幅振荡剪切（SAOS）实验中，KD在不同pH条件下的弹性模量（G′）和粘性模量（G″）表现出显著的时变特性。在起始pH为4.8的条件下，G′在约1小时内迅速增加，而G″则先下降后上升，最终达到最大值并逐渐减小。这一现象表明，KD的自组装过程伴随着结构的重组和机械性能的动态调整。当pH值下降时，弹性模量的增加可能与纤维网络的形成和增强有关，而粘性模量的变化则可能反映了纤维之间相互作用的增强或减弱。此外，研究还发现，KD在缓冲液中的自组装过程比在纯水中更快，且形成的网络结构更加紧密，这可能与其在缓冲液中能够维持更稳定的pH环境有关。

值得注意的是，KD水凝胶表现出良好的剪切稀化（shear-thinning）特性。在不同剪切速率下，其粘度会显著降低，这种特性使其在实际应用中具有优势，例如作为药物递送载体时，能够以低粘度液体形式注射，随后在目标部位形成稳定的水凝胶结构。这一特性与KD在自组装过程中形成的纤维网络有关，其结构在受到剪切力时会发生重新排列，从而降低整体粘度。然而，在pH值为3.3的条件下，KD表现出类似牛顿流体的行为，这可能与其在极端酸性条件下的自组装路径不同有关。

除了机械性能的变化，KD水凝胶的结构变化还与pH值的调节密切相关。在缓冲液中，pH值被固定在特定范围内，从而影响肽的自组装行为。研究发现，当KD在缓冲液中自组装时，其结构在较短时间内趋于稳定，而纯水中的自组装则需要更长的时间。这表明，外部缓冲对KD的自组装过程具有重要调控作用。此外，研究还通过流变学测试评估了KD水凝胶的可逆性。当KD在37°C下形成稳定结构后，将其冷却至24°C进行振幅扫描测试，结果显示其机械性能在温度变化后仍能保持一定稳定性，表明其具有良好的结构可逆性。

本研究还探讨了KD水凝胶在不同pH条件下的性能差异。在较低pH值（如pH 4.4）下，KD能够快速形成稳定的纤维网络，并表现出显著的弹性模量。而在较高pH值下，其自组装速度较慢，但形成的纤维结构可能更加致密。这种pH依赖性使得KD水凝胶在不同生理环境下具有不同的响应能力，从而拓展了其在生物医学中的应用潜力。例如，KD可以被设计为在特定pH条件下释放药物，或在特定组织环境中形成稳定的结构以保护细胞或药物。

此外，研究还发现KD水凝胶在较高温度（如35°C和37°C）下表现出更快的自组装速度，这可能与疏水相互作用的增强有关。尽管疏水作用通常被认为是弱的非共价相互作用，但它们在KD自组装过程中起到了关键作用，使得纤维网络在较高温度下仍能保持结构稳定。这种温度敏感性表明，KD水凝胶可能适用于某些需要温度调控的生物医学应用，例如在体内特定温度条件下实现药物的可控释放。

总的来说，本研究通过多学科手段，揭示了KD肽在pH响应型水凝胶形成过程中的结构和机械性能变化。结果表明，KD的自组装过程受到其内部His残基质子化状态的影响，而pH值的调节则进一步影响了纤维网络的形成和稳定性。KD水凝胶表现出良好的机械性能、结构可逆性和剪切稀化特性，这些特性使其在生物医学领域具有广阔的应用前景。未来的研究可以进一步探索KD在不同环境条件下的响应机制，以及其在药物递送、组织工程等领域的潜在应用价值。