RGB-14-P/X与参照药Prolia?/Xgeva?的全面理化与功能相似性评估：一项基于38种正交技术的生物类似药开发研究

本研究由Gedeon Richter团队开展，通过38种先进分析技术系统评估了抗RANKL单抗生物类似药RGB-14-P/X与原研药Prolia?/Xgeva?的结构与功能相似性。研究证实两者在一级/高级结构、糖基化模式、电荷变异体等关键质量属性(CQA)上高度相似，仅糖型分布和电荷变异体存在非临床意义的微小差异。该研究为全球首个针对denosumab生物类似药的全面相似性分析，为骨质疏松和骨巨细胞瘤患者提供更可及的治疗选择奠定了科学基础。

　　

在骨质疏松和骨巨细胞瘤治疗领域，抗RANKL单抗denosumab（商品名Prolia^?和Xgeva^?）通过抑制破骨细胞分化发挥重要作用。然而原研药高昂的价格限制了患者可及性，开发生物类似药成为解决这一问题的关键路径。但IgG2亚型抗体的复杂结构（含12个链内二硫键和4个链间二硫键）使得相似性评估面临巨大挑战，特别是二硫键异构体（IgG2-A/B/B）的差异可能显著影响生物活性。

Gedeon Richter的研究人员开展了迄今为止最全面的denosumab生物类似药评估研究。他们采用38种正交分析技术，对49批欧盟Prolia^?、34批美国Prolia^?、40批欧盟Xgeva^?和25批美国Xgeva^?进行系统分析，并与8批RGB-14-P和6批RGB-14-X进行对比。研究论文发表在《BioDrugs》期刊，为同类研究树立了新标杆。

关键技术方法包括：1）质谱技术（完整分子量分析、肽图分析）解析一级结构；2）氢氘交换质谱(HDX-MS)和核磁共振(2D HSQC NMR)表征高级结构；3）亲水相互作用色谱(HILIC)分析糖型；4）毛细管等电聚焦(cIEF)评估电荷变异体；5）Biolayer干涉仪(BLI)测定RANKL/FcRn结合动力学；6）报告基因法和TRAcP5b ELISA检测功能活性。

结构表征结果

通过完整质谱分析证实RGB-14与参照药具有相同的分子量变体（如G0F/G0F型147,351.4 Da）。肽图分析显示两者在互补决定区(CDR)的氧化修饰（如HC_M253氧化率2.61-4.46%）和非CDR区脱酰胺（如HC_N362脱酰胺率0.58-0.75%）等关键翻译后修饰(PTM)高度一致。

糖基化分析

HILIC-UHPLC-FL检测显示主要糖型G0F占比相似（RGB-14-P 54.8-57.0% vs 参照药52.9-67.2%），但高甘露糖型（5.7-6.9%）略高于参照药（4.9-10.4%）。通过外切糖苷酶消化结合LC-MS/MS证实两者均不含α-Gal和NGNA等免疫原性糖型。

高级结构

HDX-MS数据显示重链(HC)和轻链(LC)的氘代曲线重叠度>90%，2D NMR甲基区谱图相似性通过CCSD值统计验证（p>0.05）。微量热法(DSC)显示CH3结构域Tm3值差异（RGB-14低1-2°C）与二硫键异构体组成相关，但不影响功能。

功能活性

BLI测定sRANKL结合亲和力(KD)为2.59-4.06×10^-10 M，与参照药（1.53-5.97×10^-10 M）相当。细胞实验证实两者抑制RANKL/NF-κB信号通路（EC₅₀相似度90-110%）和破骨细胞分化（TRAcP5b抑制率92.6-105.9%）的能力无统计学差异。FcγRIIIa结合实验（KD~1.5×10^-5 M）证实两者均无ADCC效应。

参照药质量漂移现象

研究发现2019年初和2020年中参照药出现两次质量属性漂移：二硫键B型异构体从43.4-83.7%增至54.8-79.7%，单糖基化水平从6.7-32.2%降至15.2-16.0%。值得注意的是，这些变化未影响生物活性，暗示生产工艺变更可能引入了新的CQA控制策略。

该研究通过"质量源于设计"(QbD)理念，建立了目前最完善的denosumab生物类似药评估体系。特别在二硫键异构体分析方面，首次证实IgG2-B型占比差异（RGB-14 55.8-60.5% vs 参照药43.4-83.7%）不影响RANKL中和活性，这为同类生物类似药开发提供了重要参考。研究采用的动态质量范围方法（参数特异性SD乘数X=2-3）也为复杂生物药相似性评估建立了新标准。这些发现将加速高质量denosumab生物类似药上市，有望使全球更多患者受益于这一重要疗法。