SARS-CoV-2 NSP4 C端结构域动态构象转换调控病毒成熟的关键机制

本研究通过整合X射线晶体学、NMR和分子动力学模拟，首次揭示SARS-CoV-2非结构蛋白NSP4的C端结构域(NSP4-CTD)存在三种动态构象状态（未锚定/延伸锚定/螺旋锚定），其C端螺旋的形成受局部序列和整体结构调控，直接影响主蛋白酶(NSP5)对NSP4的切割效率。该发现为突破现有以成熟NSP5为靶点的抗病毒策略，开发靶向NSP4动态C端的新型干预手段提供了理论依据。

　　

研究亮点

• NSP4-CTD的C端尾部存在多态构象动态转换

• C端螺旋构象的形成具有序列和结构依赖性

• 构象变化调控NSP5介导的自切割效率

• 为靶向NSP4动态结构域的抗病毒设计提供新思路

研究结果

NSP4-CTD的C端尾部在晶体结构中呈现有序结构

我们解析了SARS-CoV-2 NSP4 C端结构域（残基408-500）的2.0 ?分辨率晶体结构（R_free=25.89%）。其核心结构域与其他冠状病毒高度保守，但C端尾部（S493-Q500）形成了两圈两亲性α螺旋，这与已知冠状病毒结构显著不同。分子动力学模拟显示该螺旋在溶液中具有动态特性，能在纳秒级时间尺度上发生构象转换。

讨论

NSP4-CTD通过前体多蛋白与病毒主蛋白酶NSP5相连。其切割效率和NSP5 N端释放直接影响蛋白酶活性。研究发现NSP4被PLPro和NSP5双重切割的特性，凸显了其在病毒生命周期中的枢纽地位。C端尾部的动态构象转换可能作为分子"计时器"，通过调节与NSP5的接触频率来控制切割时机，这种精细调控机制为开发变构抑制剂提供了结构基础。

研究方法

蛋白表达与纯化

将密码子优化的SARS-CoV-2多蛋白1a基因（含6×His标签和TEV酶切位点）克隆至pET-28a载体，转化Lemo21(DE3)菌株。使用含卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基培养，经镍柱亲和层析和凝胶过滤获得高纯度蛋白样品。晶体通过悬滴法培养，在上海光源19U1线站收集衍射数据。