新型BaseScopeTM RNA原位杂交技术在非洲水牛口蹄疫病毒携带者检测中的应用与优化研究

本研究针对口蹄疫病毒(FMDV)在携带动物中检测灵敏度不足的难题，创新性优化BaseScopeTM RNA原位杂交技术，成功实现非洲水牛(Syncerus caffer)福尔马林固定组织中FMDV RNA的可视化检测。结果表明该技术对存储3个月内的样本仍保持高敏感性，为野生动物FMDV携带机制研究提供了重要技术支撑。

　　

在非洲广袤的草原上，非洲水牛(Syncerus caffer)作为口蹄疫病毒(FMDV)的重要自然宿主，其携带的SAT血清型病毒对畜牧业构成持续威胁。传统检测方法受限于生物安全三级实验室(BSL-3)的操作要求，且对携带动物低病毒载量的检测灵敏度不足。更棘手的是，新鲜组织样本的运输受到严格限制，而福尔马林固定虽能灭活病毒，却可能导致核酸降解影响检测效果。

针对这些挑战，比勒陀利亚大学(University of Pretoria)兽医热带疾病系的研究团队创新性地将BaseScope^TM技术——一种能检测50-300核苷酸短RNA靶标的高灵敏度原位杂交(ISH)方法，应用于非洲水牛FMDV检测。这项发表在《Journal of Virological Methods》的研究证实，该技术不仅能精确定位病毒在组织中的分布，还对固定14天内、切片存储3个月内的样本保持稳定检测能力，为野生动物FMD流行病学研究提供了突破性技术手段。

研究团队采用多阶段技术路线：首先建立FMDV感染的BHK-21细胞培养体系作为阳性对照，通过多重PCR确认30头非洲水牛（15头PCR阳性）和6头实验感染牛的样本状态。关键实验环节包括：1）设计特异性探针靶向FMDV SAT2型P2/P3多蛋白基因区；2）优化福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)条件；3）系统测试氢氧化物预处理、蛋白酶III消化时间等参数；4）采用HybEZ^TM系统完成探针杂交与信号放大。

研究结果显示：在"2.5 检测"部分，优化后的BaseScope^TM成功检出所有PCR阳性样本，包括1例PCR不确定但ISH阳性的水牛。图3展示的典型阳性信号呈现为细胞质内红色颗粒，存储7天与3个月的样本信号强度无显著差异。"3.2 结果分析"揭示，延长蛋白酶III处理至30分钟、AMP7孵育60分钟可显著提升信号强度，但微波抗原修复等替代方案均告失败。

讨论部分强调，这是首次将BaseScope^TM技术应用于野生动物FMDV检测。该技术的两大突破在于：1）突破传统ISH对高表达基因的依赖，能检测单个RNA分子；2）克服福尔马林固定导致的RNA降解问题。尽管存在流程复杂（需8小时）、设备专用等局限，但其对存档样本的追溯检测能力，为理解FMDV在野生动物-家畜间的传播机制提供了新工具。正如作者Melvyn Quan等指出，这项技术特别适合受生物安全限制的地区开展FMDV追溯研究，对南非等存在野生动物-家畜传播风险的地区具有重要防疫价值。