从愿景到现实：邻近标记技术APEX与TurboID的创新协作演进及其在生命科学研究中的突破性应用

本文系统回顾了邻近标记技术(PL)中APEX和TurboID的开发历程，解决了传统蛋白质研究需破坏细胞天然状态的难题。通过酶工程改造和定向进化，研究者创建了能在活细胞中高时空精度标记邻近蛋白质的工具，已成功应用于线粒体亚区、信号通路等研究，并拓展至多种模式生物。该技术为细胞动态过程研究提供了革命性方法。

　　

在生命科学研究中，观察蛋白质如同用闪光灯拍摄夜行动物——传统方法往往需要固定或裂解细胞，这种干扰就像突然打开强光会改变动物的自然行为。20世纪末，科学家们面临着一个类似海森堡测不准原理的困境：研究蛋白质的工具本身就会改变蛋白质的真实状态。要么给蛋白质加上荧光蛋白等"标签"进行活细胞观察，要么通过抗体标记研究内源蛋白，但后者需要杀死细胞。这种非此即彼的选择严重限制了科学家对蛋白质在天然环境中真实行为的认知。

美国基因泰克公司(Genentech, Inc.)的Tess C. Branon等研究人员在《Molecular》发表的研究，讲述了如何通过APEX和TurboID这两种邻近标记技术(Proximity Labeling, PL)打破这一僵局的故事。这项技术的突破犹如给科学家配备了一台能在自然环境中无干扰观察蛋白质行为的"夜视仪"。

研究团队主要运用了三种关键技术：1) 酶工程改造，将辣根过氧化物酶(HRP)活性位点移植到抗坏血酸过氧化物酶(APX)中创建APEX；2) 酵母展示定向进化，通过22轮筛选获得高效变体TurboID；3) 串联质谱标签(TMT)定量蛋白质组学，实现多组样品同步分析。这些技术的组合应用使得在活细胞中进行高时空精度的蛋白质标记和鉴定成为可能。

历史视角：APEX与TurboID邻近标记方法的开发

研究追溯了邻近标记技术的发展历程。Alice Ting团队受两项关键研究启发：John Cronan实验室2004年关于大肠杆菌生物素连接酶BirA R118G的研究，以及Koichi Honke实验室2008年关于辣根过氧化物酶生成氮烯的工作。通过将HRP活性位点移植到APX中，并引入静电排斥突变使其单体化，最终开发出增强型抗坏血酸过氧化物酶APEX。随后的酵母展示定向进化进一步优化出APEX2，催化效率显著提高。

由于APEX依赖过氧化氢的限制，研究团队转向开发基于生物素连接酶的方法。通过22轮定向进化，最终获得TurboID和miniTurbo，这些工具仅需加入生物素即可使用，且兼容动物模型。

邻近标记与定量质谱联用

早期工作使用稳定同位素标记(SILAC)进行定量比较，如线粒体基质中495种蛋白质的鉴定，其中31种是新发现的线粒体相关蛋白。随着技术进步，串联质谱标签(TMT)成为更常用的定量方法，其18-32重 multiplexing能力大幅提高通量。最新的数据非依赖采集(DIA)技术进一步提升了数据完整性，鉴定完整度达95%。

通过质谱定义邻近标记位点

虽然鉴定邻近标记蛋白不需要确定生物素化位点，但了解这些位点有助于表征标记特征。利用生物素特异性抗体富集生物素化肽段的方法，可灵敏检测100-1000个生物素化肽段，为PL样品中的生物素化位点鉴定提供了有效手段。

用邻近标记研究蛋白质运输

传统PL方法只能提供亚细胞蛋白质组的静态快照。TransitID(通过顺序标记进行运输分析)的发明解决了这一局限。该方法使用两种正交PL酶TurboID和APEX2，分别标记蛋白质的起源位置和运输目的地，成功追踪了蛋白质从胞质或线粒体外膜向基质的转运，以及应激条件下蛋白质的核输入动态。

成功实施PL实验的实用指南

研究团队分享了实施PL实验的关键经验：需选择与生物学问题相关的模型系统；根据实验需求选择合适PL酶(APEX2适合需要高时间分辨率的实验，miniTurbo适用于过氧化氢敏感系统)；精心设计蛋白质融合构型；优化表达水平；进行全面的质量控制实验。

这项研究不仅系统回顾了邻近标记技术的发展历程，更重要的是为研究者提供了实用的技术路线图。从APEX到TurboID的技术演进，犹如为生命科学研究提供了多套可调节的"分子显微镜"，让科学家能够在不同尺度、不同环境下观察蛋白质的时空动态。这些技术的广泛应用已经并将继续推动我们对细胞生命过程的理解，从基础生物学研究到疾病机制阐明，展现出广阔的应用前景。

值得注意的是，新一代基于光激活小分子的邻近标记试剂正在兴起，它们通过电子交换机制(如Dexter能量转移或单电子转移)实现蛋白质标记，无需基因融合即可工作。这些光催化剂可在不同波长(蓝、黄、红)下激活，为研究提供了更多选择。虽然这项技术尚处于发展阶段，但它代表了邻近标记领域的又一重要突破方向。