β-arrestins通过PtdIns(4,5)P2结合驱动GPCR膜区室化：多价相互作用调控信号转导的新机制

本研究揭示了β-arrestins（βarrs）通过其新鉴定的非经典（NC）磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PtdIns(4,5)P2）结合位点与经典（C）位点协同作用，促进G蛋白偶联受体（GPCR）-βarr复合物在膜微区的聚集。通过分子动力学模拟、生物化学实验和单分子成像技术，研究人员发现NC位点对GPCR内吞和信号转导的时空调控具有关键作用，为理解GPCR信号通路的区室化调控提供了新视角。

　　

细胞信号传导的精确调控依赖于蛋白质与膜脂的动态相互作用。G蛋白偶联受体（GPCR）作为最重要的药物靶点家族，其信号终止和内吞过程主要由β-arrestins（βarrs）介导。虽然已知βarrs通过结合磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PtdIns(4,5)P₂）参与这一过程，但关于GPCR-βarr-PtdIns(4,5)P₂复合物如何在活细胞中组装和组织的时空动态仍不清楚。日本东北大学等机构的研究人员通过多学科交叉方法，揭示了βarrs通过多价PtdIns(4,5)P₂结合驱动GPCR膜区室化的新机制，相关成果发表在《Nature Chemical Biology》上。

研究团队主要运用了以下关键技术：分子动力学模拟解析βarr2-PtdIns(4,5)P₂相互作用位点；脂质体结合实验和表面等离子共振验证结合特性；NanoBiT互补发光系统监测βarr膜招募动力学；三色单分子时间分辨成像追踪V2R、βarr2和PtdIns(4,5)P₂的时空动态。

结果部分

Identification of PtdIns(4,5)P₂ interaction at the tip regions of the Barr C-domain by MD simulation

通过500纳秒的全原子分子动力学模拟，在βarr2的C结构域尖端发现了一个新的PtdIns(4,5)P₂结合位点（NC位点），包含R196、K227、K230和R332残基。与已知的C位点相比，NC位点与PtdIns(4,5)P₂的接触时间更长，特别是在GPCR存在条件下。

Liposome binding

脂质体结合实验显示，NC位点突变体（NC-4Q）和C位点突变体（C-3Q）均丧失了与含PtdIns(4,5)P₂脂质体的结合能力，表明两个位点对膜结合都至关重要。粗粒化模拟进一步证实NC位点相互作用促进C-edge环插入膜。

Synergistic effects of the C and NC sites on translocation

NanoBiT膜旁观者检测发现，NC-4Q和C-3Q突变体在class A GPCR（如V2RΔC）中的招募显著受损，而在class B GPCR（如全长V2R）中影响较小。过表达synaptojanin（SYNJ）降低PtdIns(4,5)P₂水平后，野生型βarr的招募速率降至NC-4Q水平，证实NC位点依赖PtdIns(4,5)P₂发挥作用。

NC-site-dependent rapid Barr clustering in confined domains

三色单分子成像显示，AVP刺激后，野生型和C-3Q βarr2在5分钟内形成明亮的固定簇，而NC-4Q βarr2招募延迟。隐马尔可夫模型（HMM）分析将粒子运动分为四种状态（固定、慢速、中速和快速），NC-4Q突变显著减少了βarr2、V2R和PtdIns(4,5)P₂在受限扩散状态的积累。

NC-site-dependent V2R-βarr coclustering in PtdIns(4,5)P₂ domains

共定位分析表明，NC位点对βarr2-PLCδ-PH和V2R-PLCδ-PH的共定位增强至关重要。HiBiT内吞实验证实NC-4Q βarr2介导的V2R内吞效率降低，说明NC位点通过稳定GPCR-βarr-PtdIns(4,5)P₂簇促进内吞。

这项研究揭示了βarrs通过多价PtdIns(4,5)P₂相互作用调控GPCR信号区室化的新机制。NC位点的发现不仅完善了对βarr膜招募分子机制的理解，还为开发靶向特定βarr-PtdIns(4,5)P₂相互作用的GPCR调控策略提供了理论依据。特别值得注意的是，NC位点缺陷使class B GPCR表现出class A的特征，这一发现可能为GPCR偏向性信号转导的调控提供新思路。研究采用的单分子成像技术为解析膜蛋白动态提供了范例，相关方法学创新将推动细胞信号时空组织研究的深入发展。