iPSC来源NK细胞规模化扩增工艺开发：搅拌式生物反应器实现千倍级扩增

本研究针对iPSC衍生NK细胞规模化生产难题，开发了基于搅拌式生物反应器的扩增工艺。通过优化刺激-扩增循环策略，在10L生物反应器中实现1000倍扩增，细胞毒性和IFN-γ分泌功能保持稳定，为"现货型"异体NK细胞治疗产业化提供关键技术支撑。

　　

自然杀伤细胞（NK细胞）作为癌症治疗的新星，因其独特的抗肿瘤活性和低移植物抗宿主病（GVHD）风险，成为"现货型"异体细胞治疗的理想候选。然而要实现产业化应用，必须解决两大瓶颈：一是传统培养依赖静态容器导致扩增效率低下，二是分化自诱导多能干细胞（iPSC）的NK细胞规模化生产工艺尚未建立。日本Astellas制药公司（Astellas Pharma, Inc.）CMC开发部门的研究团队在《Regenerative Therapy》发表的研究，为这一领域带来突破性进展。

研究团队创新性地采用搅拌式生物反应器替代传统静态培养，通过系统优化培养基、刺激参数和扩增条件，建立三阶段循环扩增工艺。关键技术包括：1）基于DOE实验设计优化抗体刺激条件；2）比较静态与动态培养模式；3）采用功率/体积（P/V）一致性原则进行1L到10L生物反应器放大；4）通过流式细胞术（CD3^-CD56⁺表型分析）、HiBiT荧光报告系统评估细胞毒性和IFN-γ分泌功能。所有实验均使用经伦理审查的iPSC分化NK细胞库。

【3.1 培养容器评估】研究发现125mL搅拌瓶培养3天的扩增倍数（8.2倍）显著高于静态G-Rex容器（4.3倍），且代谢参数ΔLac/ΔGluc保持稳定，证明搅拌培养可加速增殖而不影响细胞代谢。

【3.2 基础培养基评估】在四种培养基对比中，NK Xpander表现最优，深孔板培养4天扩增6.2倍，搅拌培养达6.5倍，为后续放大奠定基础。

【3.3 NK细胞再刺激评估】通过实验设计（DOE）确定初始细胞密度是影响扩增的关键因素。将刺激密度从0.68×10⁶降至0.35×10⁶ cells/mL，使二次扩增倍数从7.4倍提升至10.5倍，同时降低乳酸积累。

【3.4 可放大生物反应器评估】在1L玻璃生物反应器中，三周期循环扩增分别达到10.0、10.3和12.7倍，流式检测显示CD56⁺纯度始终＞99.8%，细胞毒性无显著差异。

【3.5 放大评估】采用恒定P/V（4.2 W/m³）策略，10L一次性生物反应器第三周期扩增达29.6倍，IFN-γ分泌量与1L规模相当，证实工艺可放大性。

这项研究首次证明iPSC-NK细胞可在通气搅拌式生物反应器中实现规模化扩增。通过创新的循环刺激-扩增策略，从冻存细胞库出发仅需9天即可获得治疗剂量细胞，较传统分化工艺大幅缩短生产周期。特别值得注意的是，研究团队采用抗体药物生产中成熟的P/V放大原则，为将来过渡到2000L级生物反应器生产奠定基础。尽管当前刺激阶段仍需依赖平面培养，但文中提出的微球偶联抗体方案为完全悬浮化生产指明方向。该成果不仅推动NK细胞治疗产业化进程，其开发思路对其它类型细胞治疗产品的工艺开发也具有重要借鉴价值。