高通量微生理系统定量解析肝纤维化关键事件：基于AOP框架的体外模型构建与应用

本研究针对肝纤维化机制研究中缺乏标准化体外模型的难题，开发了基于Akura? Twin平台的384孔高通量微生理系统（MPS），整合HepaRG/THP-1/hTERT-HSC细胞构建三维互作模型。通过TGF-β1、甲氨蝶呤（MTX）和对乙酰氨基酚（APAP）处理，定量追踪AOP（Adverse Outcome Pathway）定义的5个关键事件（KE1-KE5），证实该系统可模拟胶原沉积（COL1A1↑）、HSC激活（αSMA↑）等纤维化特征，为药物肝毒性评估提供新工具。

　　

肝脏作为药物代谢的核心器官，其毒性反应是药物研发失败的主要原因。尽管动物实验长期主导毒理学研究，但物种差异和伦理问题促使科学界寻求替代方案。近年来，微生理系统（Microphysiological Systems, MPS）和不良结局路径（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架的兴起为体外研究提供了新思路。然而，现有模型在模拟肝纤维化复杂进程时仍面临挑战——如何精准捕捉肝细胞损伤、免疫细胞激活、星状细胞转化及细胞外基质重塑等关键事件？如何实现高通量定量分析？这些问题成为阻碍肝纤维化机制研究和药物安全性评价的瓶颈。

瑞士西北应用科学与艺术大学（University of Applied Sciences and Arts Northwestern Switzerland）的Saskia Schmidt和Laura Suter-Dick团队在《Toxicology》发表的研究中，创新性地将商业化的Akura? Twin微孔板平台与AOP框架结合，构建了包含168对互连孔的高通量肝纤维化模型。该系统通过重力驱动流体交换，实现了HepaRG微组织（模拟肝细胞）、THP-1源性巨噬细胞（模拟Kupffer细胞）与hTERT-HSC微组织（模拟星状细胞）的间接共培养，避免了传统微流控系统的复杂管路问题。

研究采用三大关键技术：1）三维微组织培养技术，通过离心-倾斜法形成标准化肝细胞/免疫细胞球体；2）生物酶传感器实时监测葡萄糖/乳酸代谢；3）多组学联用策略，包括qPCR检测纤维化标志物（ACTA2、COL1A1等）、ELISA定量PAI-1/CTGF等蛋白、免疫荧光示踪αSMA应力纤维。所有实验均设置TGF-β1阳性对照、MTX纤维化模型药物和APAP阴性对照，历时10天纵向追踪。

【肝细胞损伤的定量捕捉】

通过监测白蛋白分泌和尿素合成，研究发现TGF-β1和APAP在第3天即显著抑制肝细胞功能（白蛋白↓60%），而MTX呈现延迟毒性。免疫荧光证实TGF-β1处理组肝细胞内白蛋白信号丢失，这与临床中TGF-β1诱导肝细胞凋亡的特征一致。意外的是，THP-1细胞的加入使尿素产量提升2-3倍，提示免疫细胞可能通过旁分泌支持肝细胞功能。

【免疫细胞激活的分子证据】

在AOP定义的KE2阶段，TGF-β1显著上调巨噬细胞标志物ALOX5AP（7倍）和TREM2（2倍），这两个基因分别调控炎症浸润和疤痕形成。相反，APAP抑制其表达，这与该药物急性肝毒性但不引发纤维化的临床观察相符。IL-6分泌增加进一步证实TGF-β1驱动了促纤维化的M2型巨噬细胞极化。

【TGF-β1的正反馈环路】

KE3阶段的检测揭示有趣现象：外源性TGF-β1处理7天后，内源性TGF-β1 mRNA水平暂时性升高1.9倍，同时下游标志物PAI-1的分泌在THP-1共培养组增加115%。这种自分泌放大效应可能是临床中纤维化进程难以逆转的关键机制。

【星状细胞激活的时空特征】

qPCR显示TGF-β1处理7天时，HSC激活标志物ACTA2和FN1表达分别激增5倍和5.1倍。高内涵成像定量发现αSMA⁺应力纤维数量增加3倍，纤维连接蛋白荧光强度提升400%。值得注意的是，MTX未能激活HSC，这与直接接触共培养模型的结果不同，提示药物纤维化风险可能依赖特定微环境。

【ECM重塑的动态监测】

在AOP终末事件KE5中，Pro-Collagen 1A1蛋白分泌在第7天达峰值（1.8倍），而促纤维化因子CTGF更早（第3天）即出现3.7倍升高。这种时序差异印证了CTGF作为TGF-β下游效应分子的生物学地位。

该研究通过模块化设计验证了AOP框架在体外模型的适用性，其创新性体现在三方面：首先，Akura? Twin平台首次实现168条件并行检测，通量超越传统器官芯片10倍以上；其次，建立TREM2/ALOX5AP等新型生物标志物组合，为临床前评估提供敏感指标；最后，揭示MTX纤维化风险可能需代谢异常等"二次打击"，为个性化用药提供理论基础。尽管THP-1细胞系相比原代Kupffer细胞存在分泌功能局限，但该模型已成功整合OECD推荐的AOP量化要素，为替代动物实验迈出关键一步。未来通过引入脂肪肝微环境或LSEC（肝窦内皮细胞），或将解锁更复杂的疾病建模能力。