冷冻电镜揭示Netrin-4抑制层粘连蛋白基质形成的分子机制及其肿瘤治疗潜力

本研究通过冷冻电镜技术解析了肿瘤抑制因子Netrin-4（Net4）与层粘连蛋白γ1亚基（Lm γ1）的复合物结构，揭示了Net4通过高亲和力结合Lm γ1的分子界面，竞争性抑制α1-β1-γ1异源三聚体节点组装，进而破坏细胞外基质（ECM）的层粘连蛋白（Laminin, Lm）网格形成。该研究为靶向基底膜（BM）重塑的癌症治疗策略提供了结构基础。

　　

基底膜（Basement membrane, BM）是细胞分化与极化的关键支架，其动态组装异常会导致包括癌症转移在内的多种疾病。层粘连蛋白（Laminin, Lm）作为BM的核心组分，通过α、β、γ亚基的N端短臂（LN-LE结构域）形成异源三聚体节点并聚合为平面网格。Netrin-4（Net4）是一种与Lm结构同源的肿瘤抑制因子，其表达缺失与乳腺癌侵袭性相关，但分子机制不明。

美国罗格斯大学（Rutgers University）的Arkadiusz W. Kulczyk团队联合Peter D. Yurchenco课题组，通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了Net4ΔC（缺失C端结构域的Net4）与Lm γ1ΔC的3.9 ?分辨率复合物结构，结合位点定向突变、固相结合实验和Schwann细胞模型，阐明了Net4破坏Lm网格的双重机制：一是通过高亲和力（K_d=2.93 nM）竞争性结合γ1亚基的β1结合位点，阻断三聚体节点组装；二是直接解聚已形成的Lm网格。相关成果发表于《Nature Communications》。

研究采用冷冻电镜单颗粒分析技术，结合多角度样品倾斜（10°-40°）和3D柔性优化（3D Flex）解决小分子量（97 kDa）复合物的取向偏好问题；通过LC-MS²验证N-糖基化位点；利用表面等离子共振（SPR）和原子力显微镜（AFM）量化相互作用强度与基质刚度变化；采用大鼠Schwann细胞模型验证Net4对Lm网格的体内调控作用。

结果与讨论

冷冻电镜结构解析策略

针对Net4ΔC-γ1ΔC复合物的动态性（>80%为loop结构）和小尺寸挑战，研究团队通过45,515张多角度倾斜图像采集、迭代2D分类和非均匀优化，结合DeepMainmast和AlphaFold 2交叉验证模型，最终获得局部分辨率3.4-5.6 ?的密度图。结构显示复合物呈"Y"形，Net4ΔC通过LN结构域的N1-N4区域与γ1ΔC的G1-G3区域形成1,397 ?²的界面，比β1-γ1界面大23%（图1）。

分子互作机制

静电互补性是高亲和力的关键：Net4ΔC界面带正电（图3d），而γ1ΔC和β1ΔC界面均带负电（图3c,e）。关键突变实验证实，γ1ΔC的S213R或D261R突变完全破坏结合（K_d>1 μM），而远离界面的D266R无影响（K_d=4 nM）。钙离子（Ca²⁺）通过稳定γ1的LN-LEa1连接区参与Lm节点组装，但Net4-γ1结合不依赖Ca²⁺，这解释了其组成性抑制能力。

网格破坏的双重机制

体外聚合实验显示Net4ΔC使Lm111聚合减少37%（图4a），AFM证实其将基质刚度从645.5 Pa降至191.4 Pa。Schwann细胞模型中，Net4处理使Lm EHS网格荧光信号降低60%（图4f），且对已组装网格同样有效。结构分析表明，Net4的LN结构域四环区（含N56/N163糖基化位点）与α1亚基空间冲突（图5），而β1-γ1二聚体的快速解离速率（K_d=22 μM）使Net4能高效捕获游离γ1。

结论与意义

该研究首次在原子水平揭示Net4通过"抢占-解聚"双重机制调控BM动态平衡：其高亲和力源于更大的界面面积和优化的静电互补性，而结构柔性允许其适应γ1的不同构象。这一发现为开发靶向BM硬化的抗癌药物（如模拟Net4界面肽段）提供了精确蓝图，也为层粘连蛋白病（LN-lamininopathies）的治疗策略开辟新思路。未来研究可探索Net4 C端结构域（NTR）在网格重塑中的协同作用。