氧化应激下结核分枝杆菌非典型G-四链体景观的CUT&Tag解析及其治疗靶点潜力

本研究针对结核病治疗靶点匮乏的难题，首次在细菌中应用CUT&Tag技术绘制了结核分枝杆菌(Mtb)在氧化应激条件下的G-四链体(G4)动态图谱。研究人员发现Mtb的G4结构主要分布于基因编码区，且以双鸟嘌呤基序为主，这种非典型分布模式与真核生物截然不同。更重要的是，氧化应激会显著增加G4形成并与基因表达抑制相关，揭示了G4结构在细菌应激响应中的新型调控机制，为开发针对结核病的新型抗菌策略提供了理论依据。

　　

结核病至今仍是全球公共卫生的重大威胁，每年导致数百万人感染。尽管已有抗生素治疗方案，但耐药菌株的不断出现和漫长治疗周期等问题，使得寻找新型治疗靶点迫在眉睫。结核分枝杆菌(Mtb)在感染过程中会遭遇宿主巨噬细胞产生的活性氧物质(ROS)，而细菌如何在这种氧化应激环境下调控基因表达以维持生存，一直是科学家们关注的焦点。DNA二级结构G-四链体(G-quadruplex, G4)在真核细胞中已被证实参与多种基因调控过程，但在原核生物中的存在形式和功能仍属未知领域。

来自意大利的研究团队在《Nature Communications》发表重要研究成果，首次将CUT&Tag技术成功应用于细菌系统，揭示了Mtb在氧化应激条件下独特的G4景观。这项研究不仅开发了适用于细菌的表观遗传学研究新方法，更重要的是发现了细菌G4结构的非典型特征及其在应激响应中的关键作用，为开发针对结核病的新型抗菌策略提供了全新视角。

研究人员采用CUT&Tag技术结合RNA测序等多组学方法，通过优化实验条件建立了适用于Mtb的染色质分析流程。研究使用5mM H₂O₂处理模拟巨噬细胞内氧化环境，通过抗G4抗体BG4进行全基因组定位，并与RNA聚合酶结合谱和转录组数据进行整合分析。

优化CUT&Tag用于细菌全基因组分析

研究人员首先克服技术障碍，将原本用于真核生物的CUT&Tag技术成功应用于Mtb。通过优化细菌与伴刀豆球蛋白A(ConA)磁珠结合条件、确定最佳细胞数量(1000万)等关键参数，建立了稳定的实验流程。以RNA聚合酶β亚基为阳性对照，证实该方法能准确捕获转录活跃区域，与已发表的ChIP-seq数据高度一致(94%区域重合)。

RNA聚合酶全基因组图谱

在标准培养和氧化应激条件下，研究人员绘制了RNA聚合酶的全基因组结合图谱。发现其结合位点主要分布在基因起始位点附近(36.7%)、基因内部(23.9%)和基因上游区域(21.8%)，与转录活性密切相关。氧化应激导致732个基因上调和650个基因下调，其中28.8%的上调基因与RNA聚合酶结合增加相关，包括参与ROS清除的katG等关键基因。

非常规G4景观特征

研究最引人注目的发现是Mtb中G4结构的非典型分布：

• 空间分布：约60%的G4位于基因编码区内，仅不到3%位于启动子区，与真核生物形成鲜明对比

• 结构特征：99%的G4由双鸟嘌呤基序(2-tetrad)构成，且具有短环结构

• 氧化应激响应：氧化应激条件下检测到1087个G4位点，显著多于标准条件的748个，其中50%为应激特异性G4

G4与基因表达调控的关系

整合分析显示：

• 氧化应激特异性G4与基因表达抑制显著相关(p<0.0001)

• 即使RNA聚合酶结合增加，G4的存在仍会阻碍转录延伸

• 这些G4富集于细胞壁合成和代谢相关基因，与Mtb进入休眠状态的生理适应一致

这项研究具有多重重要意义：

1. 技术突破：首次将CUT&Tag技术成功应用于原核生物，为细菌表观遗传学研究开辟新途径

2. 理论创新：揭示了细菌G4结构的非典型特征(基因体内富集、双鸟嘌呤基序主导)，挑战了基于真核生物的研究范式

3. 医学价值：发现氧化应激诱导的G4形成与基因抑制的关联，为开发针对结核病的新型抗菌药物提供了潜在靶点

研究人员特别指出，Mtb中G4结构的独特性质(如双鸟嘌呤基序的动态性)可能使其成为理想的药物靶点。与针对人类G4的药物设计相比，针对细菌特异性G4结构的药物可能具有更好的选择性。这为开发新一代抗结核药物提供了全新思路，有望解决当前结核病治疗中面临的耐药性和疗程长等挑战。

该研究由Ilaria Maurizio、Emanuela Ruggiero等完成，通讯作者为Sara N. Richter和Roberta Provvedi。研究不仅增进了我们对细菌基因调控机制的理解，也为应对全球结核病威胁提供了新的研究方向和治疗策略。