基于RELITE筛选平台的Sec61抑制剂开发：靶向PD-L1信号肽的肿瘤免疫治疗新策略

本研究开发了创新的RELITE（REsuming Luminescence upon translocatlon inTErference）筛选技术，通过干扰Sec61转位复合物功能，特异性抑制PD-L1蛋白的ER（内质网）转运。研究人员利用荧光素酶活性恢复原理，从100种CADA类似物中鉴定出BL458等高效抑制剂，可选择性降解PD-L1（IC50≈263 nM），且不影响Calnexin等Sec61常规底物。该策略为开发靶向信号肽（SP）的肿瘤免疫治疗药物提供了新思路。

　　

免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1在肿瘤免疫逃逸中起关键作用，但现有抗体疗法仅对部分患者有效。由于PD-L1表达受多层面调控，开发能直接干预其生物合成的小分子抑制剂成为研究热点。Sec61转位复合物作为内质网（ER）蛋白转运的核心通道，其选择性抑制为靶向降解PD-L1提供了可能，但现有筛选方法存在假阳性率高、耗时长等问题。

来自意大利Telethon遗传与医学研究所（TIGEM）等机构的研究团队在《Nature Communications》发表研究，开发了基于荧光素酶活性恢复的RELITE高通量筛选平台。该技术利用Sec61抑制剂干扰信号肽（SP）介导的蛋白转运时，会导致滞留在胞质的荧光素酶短暂恢复活性的特性，在6小时内即可完成抑制剂筛选。通过该平台，研究者从CADA类似物库中鉴定出能特异性靶向PD-L1信号肽的化合物BL458，证实其通过阻断Sec61α的R66位点（IC₅₀差异达8倍），诱导未转运的PD-L1前体被蛋白酶体降解。研究还发现BL458可有效抑制肿瘤细胞与巨噬细胞共培养诱导的PD-L1上调（抑制率>50%），且对PBMCs（外周血单核细胞）中Treg细胞（CD4⁺CD25^highCD127^dim）具有选择性抑制。

关键技术包括：1）构建含PD-L1信号肽的荧光素酶-海肾荧光素酶双报告系统；2）基于Z因子（0.84）优化的96孔板高通量筛选；3）蛋白质组学分析（PRIDE数据库编号PXD063288）；4）流式细胞术检测PD-L1膜表达；5）Sec61α-R66I突变体耐药性验证。

【RELITE筛选平台的开发】

通过改造荧光素酶（FLuc）的N197糖基化位点，使其ER转运后失活。当Sec61抑制剂干扰转运时，胞质中快速折叠的FLuc短暂恢复活性（半衰期约30分钟），该信号可通过FLuc/RLuc（海肾荧光素酶）比值量化。相比传统GLuc（高斯荧光素酶）分泌检测法，RELITE对Brefeldin A等分泌通路干扰剂不敏感，特异性提升50%。

【PD-L1特异性抑制剂的发现】

在GB138胶质瘤模型中，BL458对携带天然信号肽（SPn）的PD-L1抑制效力（IC₅₀ 263 nM）显著高于突变型（SPm，三处极性氨基酸替换为亮氨酸）。冷冻电镜显示BL458与Sec61α的R66残基相互作用，该位点突变使IC₅₀升至2 μM。

【作用机制解析】

BL458处理导致PD-L1非糖基化前体（NG）在胞质积累（S100组分），经MG132（蛋白酶体抑制剂）处理后可见分子量略大于EndoH（内切糖苷酶）消化产物的条带，证实为未切除信号肽的前体形式。脉冲追踪实验显示1小时短暂暴露即可产生持续10小时的抑制效果，提示BL458可能在Sec61通道内长期滞留。

【生理相关性验证】

在PBMCs-CD3/CD28激活模型中，BL458使单核细胞PD-L1⁺比例从29.13%降至14.55%。与巨噬细胞共培养的GB138细胞，其PD-L1表达量（MFI）从4.84倍降至0.85倍，而低表达PD-L1的HeLa细胞不受影响。蛋白质组学显示20 μM BL458仅影响1.9%的分泌途径相关蛋白。

该研究首次实现基于信号肽特性的Sec61抑制剂精准筛选，突破传统方法需多轮验证的瓶颈。BL458对PD-L1的靶向降解不依赖其表达水平或诱导条件，为克服肿瘤免疫治疗耐药性提供新工具。RELITE平台可扩展至其他疾病相关蛋白的抑制剂开发，如病毒包膜蛋白或自身免疫病靶点。值得注意的是，虽然BL458对Sec61α的R66位点具有选择性，但蛋白质组数据提示需进一步优化以提高绝对特异性。未来研究可结合冷冻电镜解析BL458-Sec61-PD-L1信号肽三元复合物结构，为理性设计更高效抑制剂提供依据。