利用先进体外3D肝脏模型和纠错双链测序技术揭示马兜铃酸诱导的突变特征

本研究针对传统遗传毒性测试方法的局限性，开发了结合3D HepG2肝球体模型与纠错双链测序(DS)的创新平台。研究人员通过重复暴露马兜铃酸(AA)实验，首次在体外模型中检测到与人类癌症相关的SBS22特征突变谱，证实该模型能有效评估化学物质诱导的固定DNA损伤。这一突破为致癌机制研究提供了高效、经济的替代动物实验方案，对提升危害评估准确性具有重要意义。

　　

在化学物质安全评估领域，传统遗传毒性测试方法正面临严峻挑战。Ames试验、哺乳动物细胞突变试验等金标准虽然沿用数十年，但其依赖动物模型、检测周期长、仅能评估特定基因位点等缺陷日益凸显。更棘手的是，二维(2D)细胞培养系统难以模拟真实器官微环境，而现有三维(3D)模型又缺乏检测点突变的有效手段。这种技术断层严重制约着致癌物风险评估的准确性和效率。

针对这一科学瓶颈，英国斯旺西大学医学院（Swansea University Medical School）生命科学研究所体外毒理学组联合国际癌症研究机构(IARC)的科学家们开展了一项创新研究。他们巧妙地将先进3D肝脏模型与纠错新一代测序(ecNGS)技术相结合，建立了一个能同时检测染色体损伤和点突变的综合评估平台。这项突破性成果近期发表在《Mutagenesis》期刊，为现代毒理学研究提供了新范式。

研究团队采用三大核心技术：首先建立可维持14天高活性的3D HepG2肝球体培养系统，通过白蛋白/尿素分泌和CYP1A1表达验证其肝功能；其次运用微核试验评估马兜铃酸(AA)诱导的染色体损伤；最关键的是采用双链测序(DS)技术，通过TwinStrand? DuplexSeq?人类诱变试剂盒对48kb靶区域进行超低频突变检测，并借助SigProfiler工具进行突变特征分析。

研究结果部分，"先进3D HepG2肝脏模型的表征"显示，4000细胞/球体的培养体系能形成边界清晰的球状结构，维持>50%存活率达14天。肝功能指标显示白蛋白分泌稳定，尿素产量在第5天达峰值(0.7ng/μl)后缓慢下降，证实模型适合长期毒性研究。"马兜铃酸诱导的遗传毒性反应"部分发现，10-15μM AA重复暴露4天后，微核率显著增加(P<0.05)，但5μM剂量仅能通过DS检测到损伤，凸显后者更高灵敏度。

在"HepG2肝球体适用于DS突变特征分析"部分，研究取得关键突破：AA处理组呈现明显的T:A>A:T突变优势(图4A)，与人类AA相关癌症的COSMIC特征SBS22高度吻合(图4B)。特征分解显示SBS22贡献率达41%，且仅存在于暴露组(图4D)，而背景信号SBS40(54%)在两组均有分布。这一发现首次在体外重现了AA的致癌特征指纹。

这项研究通过整合3D器官模型与ecNGS技术，实现了多重突破：一是建立经济高效的肝球体培养方案，支持长达两周的实验周期；二是验证DS技术对体外模型点突变检测的适用性，其灵敏度超越传统微核试验；最重要的是成功捕捉到AA特异的SBS22特征，为化学致癌物风险评估提供了分子指纹工具。Gillian E Conway等研究者强调，该方法无需细胞克隆扩增，大幅缩短检测周期，且能同时评估基因组多位点损伤，有望革新现有测试策略。

讨论部分指出，虽然DS技术存在成本高、需专业分析的局限，但随着测序价格持续下降和标准化进程推进，其与传统方法的组合将形成更全面的评估体系。该研究不仅为AA的肝毒性机制提供新证据，更开创性地证明体外模型也能重现人类癌症突变特征，这对推动动物实验替代和精准毒理学发展具有里程碑意义。未来研究可扩展至其他致癌物筛查，并探索将检测区域从48kb扩展至全基因组，进一步提升预测价值。