使用Plackett-Burman实验设计，通过Alcalase?2.4 L酶从Pterygoplichthys pardalis鱼中提取油脂

《Applied Food Research》：Oil extraction from Pterygoplichthys pardalis with Alcalase?2.4 L using Plackett-Burman experimental design

该研究针对入侵物种Pterygoplichthys pardalis，通过Plackett-Burman设计优化酶解条件，以Alcalase?2.4 L提取鱼油，最佳参数为2%酶浓度、60°C、pH 8、60rpm搅拌、234分钟水解及2:1缓冲液比例，理论提取率54.60%，实测44%。油中饱和脂肪酸45.77%、单不饱和13.87%、多不饱和40.36%，重金属含量符合食品安全标准，显示其作为Omega-3/-6/-9来源的潜力及食品工业应用价值。

　　### 研究背景与意义

在许多地区，外来物种的引入往往会对当地的生态系统和经济活动造成深远的影响。其中，*Pterygoplichthys pardalis*（俗称“清道夫”）作为一种原产于亚马逊盆地的鱼类，被引入墨西哥后迅速扩散至东南部的河流和湖泊中，对当地的水产养殖业构成了挑战。这一物种的扩散不仅影响了本地鱼类的生存，还对依赖渔业为生计的社区造成了经济损失。然而，面对这一问题，科学家们开始探索如何将这种外来物种转化为具有经济价值的资源，以减少其对生态环境的负面影响。

*P. pardalis* 的脂肪含量较高，因此其油脂被视为一种有价值的副产品。这种油脂富含多不饱和脂肪酸（PUFAs），这些脂肪酸在食品和医药行业中具有广泛应用，尤其是在治疗心血管疾病、炎症性疾病以及神经退行性疾病方面。此外，脂肪酸在生物技术研究中也扮演着重要角色，能够促进细胞膜的流动性，参与细胞内信号传导过程，并有助于生成具有生物活性的脂质分子，如二十烷酸类物质。

传统的油脂提取方法通常依赖于有毒溶剂，这在食品工业中存在一定的健康和环境风险。因此，研究者们开始寻求更环保的替代方法，如超临界流体辅助提取、微波辅助提取和超声波辅助提取等。这些方法不仅减少了对环境的污染，还提高了提取效率，减少了溶剂的使用量。

在这些方法中，酶解提取技术因其“绿色”特性而备受关注。它通过酶的作用将蛋白质分解，释放出脂肪，从而实现油脂的高效提取。这种技术不仅可以提高油脂的提取率，还可以保持脂肪酸的完整性，避免高温和化学试剂对脂肪酸结构的破坏。此外，酶解提取的副产物，如蛋白质水解物，还可以被重新利用，用于生产动物饲料等其他产品，这使得该技术在可持续性方面具有显著优势。

本研究的目标是优化 *P. pardalis* 油脂的提取过程，通过使用 Alcalase? 2.4 L 酶进行酶解，提高油脂提取率并集中多不饱和脂肪酸的含量。这一研究不仅有助于解决外来物种带来的生态问题，还可能为食品和医药行业提供新的原料来源，推动可持续发展。

### 实验方法与材料

本研究采用了系统的方法来评估和优化 *P. pardalis* 的油脂提取过程。首先，从 Usumacinta 河中收集 *P. pardalis* 样本，样本长度在 30 至 40 厘米之间。这些样本经过去内脏、清洗和冷冻处理后，被运送到 TecNM/I.T. Tuxtla Gutiérrez 的食品化学实验室。随后，将样本切割成 8 至 10 厘米的小块，包括头部、肌肉、骨骼、尾部和鳍，并在 60 °C 下干燥至恒重。最后，将干燥后的样本研磨成细粉，用于后续实验。

为了评估油脂的提取效率和脂肪酸的组成，研究团队使用了多种化学试剂和设备。其中，Alcalase? 2.4 L 是一种从 *Bacillus licheniformis* 中提取的蛋白酶，能够有效分解蛋白质，释放脂肪。此外，还使用了磷酸缓冲液、氢氧化钠、BF?/MeOH（14%）等化学试剂，用于脂肪酸的分析。通过气相色谱技术，研究团队能够精确测定脂肪酸的组成，并评估其在不同实验条件下的变化。

为了确定最佳提取条件，研究团队采用了 Plackett-Burman 实验设计。该方法是一种部分因子设计，能够通过较少的实验次数识别出对提取效率有显著影响的变量。在本研究中，评估了六个主要变量：酶浓度、pH 值、温度、搅拌速度、水解时间和缓冲液与原料的比例。通过该设计，研究团队能够筛选出关键影响因素，并进一步优化提取条件，以达到最高的油脂提取率。

### 实验结果与分析

实验结果表明，Alcalase? 2.4 L 的浓度和水解温度是影响油脂提取率的两个主要因素。研究团队发现，当 Alcalase? 2.4 L 浓度为 2% 时，油脂提取率显著提高。此外，水解温度为 60 °C 时，提取效率也达到最佳状态。这些结果表明，温度和酶浓度在油脂提取过程中起到了关键作用。

通过进一步的优化，研究团队确定了最佳提取条件为：Alcalase? 2.4 L 浓度为 2%，水解温度为 60 °C，pH 值为 8，搅拌速度为 60 rpm，水解时间为 234 分钟，缓冲液与原料的比例为 2:1（体积与重量比）。这些条件预测的油脂提取率为 54.60%，并且通过验证实验，实际提取效率为 44%。虽然实际提取率略低于预测值，但这一结果仍然表明酶解提取技术在油脂提取方面的可行性。

此外，研究团队还对提取的油脂进行了脂肪酸组成分析。结果显示，油脂中含有 45.77% 的饱和脂肪酸（SFA）、13.87% 的单不饱和脂肪酸（MUFA）和 40.36% 的多不饱和脂肪酸（PUFA）。这些脂肪酸中，PUFA 占比较高，尤其是属于 ω-3 和 ω-6 家族的脂肪酸，如亚油酸、γ-亚麻酸和二十碳五烯酸（EPA）等。这些脂肪酸在人体健康中具有重要作用，例如降低胆固醇水平、改善心血管健康以及调节免疫反应。

值得注意的是，研究团队还评估了提取油脂中的重金属含量，以确保其安全性。结果表明，所提取的油脂中重金属含量均低于 FAO/WHO 的安全标准，这表明该油脂可以安全地用于食品和医药行业。

### 讨论与结论

本研究的结果表明，酶解提取技术在 *P. pardalis* 油脂提取中具有显著优势。首先，该技术能够在不使用有毒溶剂的情况下，实现较高的油脂提取率，从而减少对环境的污染。其次，提取过程中，脂肪酸的组成得以保留，确保了油脂的营养价值。最后，该技术的副产物可以被重新利用，为农业和畜牧业提供额外的资源，提高整体的资源利用率。

然而，尽管酶解提取技术在实验室条件下表现出良好的效果，但在实际应用中仍需进一步研究。例如，提取过程中的变量如鱼类的季节性变化、采集地点的环境差异等，都可能对油脂提取率和脂肪酸组成产生影响。因此，未来的研究需要考虑这些因素，以确保提取方法的稳定性和可重复性。

此外，本研究还强调了 *P. pardalis* 油脂在食品工业中的潜力。由于其富含 ω-3 和 ω-6 脂肪酸，这种油脂可能成为一种新的健康食品原料。然而，为了确保其在食品中的安全性，还需要进一步的评估，以确认其是否符合 Generally Recognized as Safe（GRAS）标准。

综上所述，本研究为 *P. pardalis* 的利用提供了新的思路。通过优化提取条件，不仅提高了油脂的提取率，还确保了其质量。这一研究不仅有助于解决外来物种带来的生态问题，还可能为食品和医药行业提供新的资源来源，推动可持续发展。未来的研究可以进一步探索该油脂的其他应用潜力，以拓展其在不同领域的价值。