瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中胞外多糖合成的分子机制：结构特征与基因组学之间的关系

《Carbohydrate Polymers》：Molecular mechanisms for exopolysaccharides synthesis in Lactobacillus helveticus: Relationship between structural characteristics and genomics

Lactobacillus helveticus胞外多糖（EPS）合成机制及分子量调控研究，通过46株基因组比较和全基因组关联分析，发现UDP-N-乙酰葡糖胺-2-庚二酸及α-1,2-L-鼠李糖转移酶等基因与EPS产量及分子量相关，C→T突变影响多糖结构。高Mn EPS显著提升发酵乳凝胶特性，验证了基因组学与GWAS结合分析EPS功能的重要性。

　　在发酵乳制品的加工过程中，胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）发挥着重要作用。EPS不仅能够改善产品的质地和感官特性，还对乳制品的保质期和储存稳定性有显著影响。然而，目前对于EPS生物合成过程的调控机制以及其结构特征的了解仍然有限。本研究通过对46株嗜热链球菌（Lactobacillus helveticus）的基因组进行分析，并结合EPS的产量和分子量数据，首次应用全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies, GWAS）方法，探索影响EPS生物合成的分子机制。研究发现，某些假想蛋白和UDP-N-乙酰半乳糖胺-2-庚二酸的编码基因与EPS的产量和平均分子量（Mn）存在显著关联，但其影响趋势相反。此外，α-D-葡萄糖胺α-1,2-鼠李糖转移酶和UDP-半乳糖吡喃糖互变酶仅与EPS的Mn相关，而不影响EPS的产量。研究还指出，EPS生物合成蛋白中的C→T突变会导致EPS的Mn显著降低，而同一突变在Wzz/Phepe/Etk N端结构域包含蛋白中则会显著提升EPS的产量。进一步实验表明，高Mn的EPS能够增强发酵乳的质地、保水能力和流变特性。本研究不仅揭示了嗜热链球菌EPS生物合成的遗传基础，还验证了基因组比较分析与GWAS相结合的方法在分析乳酸菌EPS结构差异方面的有效性，为后续的基因编辑和产品优化提供了重要的理论依据和实践指导。

嗜热链球菌是一种在乳制品发酵中广泛应用的关键微生物，因其高效的蛋白质降解能力、快速的酸产生以及多种益生功能而受到重视。然而，大多数嗜热链球菌菌株在粘液生成方面存在不足，这限制了其在乳制品改良中的应用。为了克服这一问题，提高其EPS的性能成为研究的热点。EPS作为一种生物大分子，能够显著提升发酵乳制品的粘度、凝胶硬度、保水能力和感官特性，进而延长产品的货架寿命。其功能主要取决于分子量、分支程度和碳骨架的刚性。较高的分子量和刚性的碳骨架（如通过β-(1→4)糖苷键连接）能够有效增加体系的粘度，而分支结构则有助于进一步增强骨架的稳定性。

在过去三十年中，随着EPS在商业价值和应用潜力方面的不断提升，研究人员和乳制品企业对乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）EPS的研究取得了显著进展。特别是借助第二代测序技术和分子生物学手段，EPS的基因及其调控机制得到了深入解析。通过大规模并行测序（50-300 bp），结合全基因组测序和转录组分析，研究者已经成功识别出多个与EPS合成相关的基因和调控元件。在乳酸菌中，EPS的合成主要通过两种途径：一种是胞外糖基转移酶途径，另一种是Wzx/Wzy依赖途径。其中，Wzx/Wzy依赖途径是乳酸菌中合成异多糖EPS的主要方式，特别是在嗜热链球菌中尤为常见。该途径包括五个关键步骤：糖的运输、前体糖核苷酸的合成、重复单元的合成与锚定、通过翻转酶介导的跨膜运输，以及重复单元的聚合与释放。值得注意的是，与EPS合成相关的前两个步骤的基因并不位于EPS基因簇中，这使得EPS的合成过程更加复杂。

在乳酸菌研究领域，GWAS方法已被用于筛选与特定表型相关的基因变异。最初，这种方法在人类疾病研究中广泛应用，通过大规模样本数据的统计分析，成功识别出与疾病表型相关的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）。近年来，GWAS方法也被引入到乳酸菌研究中，用于分析EPS产量和分子量的遗传基础。例如，有研究利用GWAS方法识别了与Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus基因组中酸产生性能显著相关的SNP，并通过实验验证了这些预测结果的有效性。然而，尽管GWAS在乳酸菌研究中已取得一定进展，但对于SNP位点如何具体影响乳酸菌EPS的产量和分子量，仍缺乏深入的探索。因此，有必要进一步加强对这一领域的研究，以揭示更详细的分子机制。

本研究的目的在于更好地理解嗜热链球菌EPS的分子量和产量的变异情况，并识别潜在的基因编辑位点，从而优化EPS的性能。为此，我们基于46株嗜热链球菌的EPS产量和分子量数据，利用比较基因组学和GWAS方法，鉴定了参与EPS生物合成和连接的关键编码蛋白及SNP位点。随后，我们通过EPS结构特征与关键编码基因之间的相关性分析，进行了初步的功能验证。此外，我们还通过KEGG通路分析进一步明确了两个基因在EPS合成中的具体作用。同时，我们对不同Mn EPS对发酵乳凝胶性能的影响进行了系统研究。这些研究不仅揭示了乳酸菌EPS生物合成的遗传基础，还阐明了EPS的结构与功能之间的关系，为未来乳制品的品质改良和功能性开发提供了新的思路和方法。

为了实现这一研究目标，我们首先从东北农业大学食品学院获得了所需的46株嗜热链球菌。这些菌株是从奶酪、酸奶等乳制品中分离得到的，并已被证实适用于发酵食品的研究。实验中使用的培养基为12%脱脂乳培养基，培养条件为在37°C下进行24小时发酵。在基因组提取过程中，我们采用了一种标准化的流程，确保样本的高质量和一致性。具体来说，我们取1 mL活化的细菌悬液进行离心处理，离心后去除上清液，保留菌体进行后续操作。这一步骤对于获得纯净的基因组DNA至关重要，有助于后续的基因组测序和分析。

在基因组测序方面，我们采用了Illumina HiSeq高通量测序平台，对46株嗜热链球菌进行了全基因组重测序。测序深度平均达到300×，以确保数据的准确性和可靠性。测序结果表明，这些菌株的基因组由平均187.89条contig组成，N50值为21.56 ± 4.15 kb。基因组大小在1.83至2.42 Mb之间，平均为1.96 ± 0.11 Mb，且整体GC含量为36.57% ± 0.20%。这些数据不仅反映了嗜热链球菌基因组的复杂性，也揭示了不同菌株之间在基因组结构上的差异。进一步的基因组分析显示，EPS合成相关的基因通常以基因簇的形式存在，且其核苷酸序列和基因模块具有高度的变异性。插入序列是导致EPS基因簇多样性的重要原因之一，这种多样性使得不同菌株的EPS特性存在显著差异。即使是同一物种的不同菌株，其EPS基因簇和EPS特性也可能表现出明显的不同。

本研究的发现对于理解嗜热链球菌EPS的生物合成机制具有重要意义。首先，我们发现假想蛋白和UDP-N-乙酰半乳糖胺-2-庚二酸的编码基因与EPS的产量和分子量之间存在显著关联，但其影响方向相反。这意味着，某些基因的变异可能同时影响EPS的产量和分子量，但具体的影响方向需要进一步研究。其次，α-D-葡萄糖胺α-1,2-鼠李糖转移酶和UDP-半乳糖吡喃糖互变酶仅与EPS的分子量相关，而不影响其产量。这表明，某些基因可能主要调控EPS的分子量，而非其总体产量。此外，我们还发现，EPS生物合成蛋白中的C→T突变会导致EPS的平均分子量显著降低，而同一突变在Wzz/Phepe/Etk N端结构域包含蛋白中则会显著提升EPS的产量。这一发现不仅揭示了特定基因突变对EPS性能的影响，还为基因编辑提供了潜在的靶点。

在实验验证方面，我们通过分析EPS的结构特征与其关键编码基因之间的相关性，初步验证了这些基因的功能。同时，我们还通过KEGG通路分析进一步明确了两个基因在EPS合成中的具体作用。KEGG通路分析是一种系统的方法，能够揭示基因在生物代谢过程中的功能和相互作用。通过这一分析，我们不仅确认了这些基因在EPS合成中的重要性，还发现它们可能通过不同的代谢途径影响EPS的结构和性能。此外，我们还对不同Mn EPS对发酵乳凝胶性能的影响进行了系统研究。结果表明，高Mn EPS能够显著增强发酵乳的质地、保水能力和流变特性。这说明，EPS的分子量与其功能特性之间存在密切的联系，且分子量的提高可以带来更好的产品性能。

本研究的结论具有重要的理论和应用价值。首先，我们通过整合比较基因组学和GWAS方法，首次揭示了嗜热链球菌EPS生物合成的遗传基础。这一发现为理解乳酸菌EPS的生物合成机制提供了新的视角，并有助于进一步探索其调控网络。其次，我们识别了三个具有显著基因组和EPS特征变异的进化类群，这表明嗜热链球菌在基因组和EPS性能方面存在丰富的遗传多样性。这种多样性可能为不同应用场景下的EPS优化提供了潜在的资源。此外，我们发现关键基因的突变对EPS的产量和分子量具有相反的影响，这为基因编辑提供了明确的靶点。例如，EPS生物合成蛋白中的C→T突变会导致EPS的分子量降低，而Wzz/Phepe/Etk N端结构域包含蛋白中的C→T突变则会显著提升EPS的产量。这一发现不仅有助于理解基因突变对EPS性能的影响，还为通过基因编辑手段改良EPS特性提供了理论依据。

本研究还验证了高Mn EPS对发酵乳凝胶性能的积极影响。通过实验，我们发现高Mn EPS能够显著改善发酵乳的质地和流变特性，这表明EPS的分子量是影响其功能性能的关键因素之一。这一结果对于乳制品工业具有重要的指导意义，因为高分子量EPS通常能够提供更好的稳定性和结构强度，从而提升产品的品质和市场竞争力。此外，本研究的成果也为未来乳酸菌EPS的研究提供了新的方向。例如，可以进一步探索不同基因突变对EPS性能的具体影响，以及如何通过基因工程手段优化EPS的合成路径。这些研究不仅有助于提升乳制品的营养价值和功能性，还可能为开发新型功能性食品提供理论支持和技术手段。

在本研究的作者贡献方面，各作者在研究的不同阶段发挥了重要作用。Kangyong Zhang负责撰写和审阅论文、方法设计、数据分析、数据管理以及研究概念的提出；Xuemei Zhang参与了论文的撰写和审阅，以及方法设计和数据管理；Xuefeng Qi负责论文的撰写和审阅，以及方法设计；Sufang Duan参与了论文的撰写和审阅，以及数据管理；Zhen Feng负责论文的撰写和审阅，以及方法设计；Pimin Gong参与了论文的撰写和审阅；Zhen Wu负责论文的撰写和审阅，以及方法设计；Bailiang Li负责论文的撰写和审阅。所有作者的共同努力使得本研究得以顺利完成，并为乳酸菌EPS的遗传调控机制提供了新的见解。

本研究的成果得到了多项资助的支持。其中包括国家自然科学基金（项目编号：32101919）、国家奶业技术创新中心青年人才项目（项目编号：2023-QNRC-4）以及中国博士后科学基金会（项目编号：2024 T170256）。这些资金的投入不仅保障了实验的顺利进行，也为研究的深入拓展提供了必要的资源。此外，本研究的成果也得到了同行评审的认可，为乳酸菌EPS的研究领域贡献了新的数据和方法。未来，随着基因组学和生物信息学技术的不断发展，EPS的遗传调控机制将进一步被揭示，为乳制品工业的创新和发展提供更坚实的基础。