表型和转录组分析揭示了柠檬香叶油（Litsea cubeba essential oil）对抗蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的抗菌膜形成机制及其在猪肉保鲜中的应用

《Current Research in Food Science》：Phenotypic and transcriptomic analysis reveals the antibiofilm mechanism of Litsea cubeba essential oil against Bacillus cereus and its application in pork preservation

枯草芽孢杆菌生物膜抑制及机制研究及在猪肉防腐中的应用。

　　这项研究聚焦于一种天然植物精油——山鸡椒（*Litsea cubeba*）精油（LC-EO）对引起食物中毒的常见病原菌——蜡样芽孢杆菌（*Bacillus cereus*）生物膜的抑制作用及其潜在机制。研究不仅探讨了LC-EO在抗菌和抗生物膜方面的效果，还通过表型分析、转录组学和分子对接等多学科手段，揭示了其对细菌群体感应系统（QS）的影响，并评估了其在猪肉保鲜中的应用潜力。这些发现为开发新型天然抗菌剂提供了理论支持和实践指导。

### 蜡样芽孢杆菌与生物膜的危害

蜡样芽孢杆菌是一种广泛存在于土壤、水源和食品中的革兰氏阳性菌，其代谢产物能够引发人类的多种胃肠道疾病，包括腹泻和呕吐。这类细菌在食物生产环境中极易存活并形成生物膜，而生物膜是其在恶劣环境中长期生存的关键结构。生物膜由微生物细胞组成，通常被一层自产的胞外聚合物物质（EPS）包裹，其中包含多糖、蛋白质和胞外DNA（eDNA）。这种结构使得细菌能够抵御外界环境的侵害，从而在食物表面或内部持续定植，增加食品安全风险。

生物膜的形成是一个复杂而动态的过程，通常分为四个阶段：细菌附着、微菌落形成、生物膜成熟和扩散。这一过程不仅依赖于细菌自身的生理活动，还受到群体感应系统的调控。群体感应系统是一种细菌通过感知细胞密度变化，调控基因表达的机制，其中AI-2/LuxS系统在调控生物膜形成、毒力因子分泌和运动能力方面具有重要作用。

### LC-EO的抗菌与抗生物膜作用

LC-EO是从山鸡椒果实中提取的挥发性次生代谢产物，主要成分包括柠檬醛（citral）和柠檬烯（limonene）等。这些成分在多种细菌和真菌中表现出良好的抗菌活性，尤其是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、副溶血性弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）、大肠杆菌（*Escherichia coli*）和沙门氏菌（*Salmonella typhimurium*）等具有显著的抑制作用。然而，尽管已有大量关于LC-EO抗菌活性的研究，针对其抗生物膜作用的探讨仍较为有限，特别是其作用机制方面。

本研究通过表型和转录组学方法，评估了LC-EO对蜡样芽孢杆菌生物膜的抑制效果。实验结果显示，LC-EO的最小抑菌浓度（MIC）为0.125 mg/mL，最小生物膜抑菌浓度（MBIC）为0.250 mg/mL。这些浓度显著降低了生物膜的形成，破坏了其三维结构，并显著减少了胞外DNA的含量。此外，LC-EO几乎完全抑制了蜡样芽孢杆菌的游泳运动能力，表明其对细菌的运动功能具有明显的影响。

在生物膜形成初期，细菌的附着能力主要依赖于其运动能力，包括游泳、扩散和颤动三种方式。LC-EO在不同浓度下对这些运动方式均表现出抑制作用，其中对游泳运动的抑制最为显著。在生物膜形成过程中，LC-EO通过降低细菌的附着率和运动能力，显著削弱了其形成生物膜的能力。这一发现与之前的抗菌精油研究结果相似，表明LC-EO在抑制生物膜形成方面具有潜在的应用价值。

### LC-EO对生物膜成分的影响

生物膜的形成依赖于胞外多糖（EPS）、胞外蛋白和胞外DNA等成分。LC-EO对这些成分的影响在本研究中得到了深入分析。结果显示，LC-EO对胞外多糖和胞外蛋白的含量影响较小，但对胞外DNA的抑制作用非常显著。在1/2 MBIC和MBIC浓度下，eDNA含量分别从3.31降至2.28和1.47 μg/mL。这可能是因为柠檬醛能够与细菌DNA结合，改变其结构，从而减少eDNA的释放。同时，LC-EO对细菌的代谢能力也有显著抑制作用，随着处理浓度的增加，生物膜中细菌的代谢活性持续下降，表明其对生物膜的形成具有较强的干扰能力。

### 转录组学揭示LC-EO的作用机制

为了进一步揭示LC-EO对蜡样芽孢杆菌生物膜形成的影响机制，本研究采用转录组学技术分析了其对相关基因表达的调控作用。结果显示，LC-EO在1/4 MBIC浓度下处理12小时和24小时后，分别导致1076个和409个差异表达基因（DEGs）。其中，518个和185个基因被显著上调，而558个和224个基因被显著下调。这表明LC-EO对蜡样芽孢杆菌的基因表达具有多方面的调控作用。

通过GO功能富集分析和KEGG通路分析，发现LC-EO主要影响与小分子代谢、有机氮化合物代谢和嘧啶类化合物相关的基因表达。同时，其对氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、膜转运和信号传导等通路也有显著影响。这些结果表明，LC-EO可能通过干扰细菌的代谢过程和信号传导系统，从而抑制其生物膜的形成。

此外，LC-EO还显著抑制了与生物膜形成和毒力因子分泌相关的基因表达。例如，*fla*和*fliY*基因是与鞭毛运动相关的重要基因，其表达水平的降低意味着细菌的运动能力受到抑制，进而影响其生物膜的形成。同时，*codY*、*SinR*、*SinI*和*plcR*等基因的表达也被显著抑制，这些基因在生物膜形成和毒力因子调控中起着关键作用。

### 分子对接验证LC-EO的作用靶点

为了进一步验证LC-EO的作用机制，研究者采用了分子对接技术，分析其主要活性成分柠檬醛与蜡样芽孢杆菌AI-2/LuxS群体感应系统中关键酶蛋白的相互作用。结果显示，柠檬醛能够与LuxS、MetC、MetK、LsrF和LsrK等关键蛋白形成稳定的结合复合物，其结合能量分别为-5.2 kcal/mol、-4.7 kcal/mol、-5.7 kcal/mol、-5.9 kcal/mol和-5.6 kcal/mol。结合能量的绝对值越大，说明其与目标蛋白的结合越稳定，因此柠檬醛可能通过与这些关键蛋白相互作用，干扰AI-2信号的合成和传递过程。

在这些关键蛋白中，LsrK表现出最强的结合能力，结合能量最低，表明柠檬醛可能优先作用于LsrK，阻断AI-2信号的磷酸化和激活过程。同时，柠檬醛对LuxS和LsrF的结合稳定性也接近LsrK，这表明其可能通过同时抑制多个关键酶，实现对AI-2信号通路的全面干扰。这些结果与qRT-PCR实验中观察到的基因表达下调现象高度一致，进一步支持了LC-EO通过干扰AI-2信号通路抑制生物膜形成的机制。

### LC-EO在猪肉保鲜中的应用潜力

除了在抗菌和抗生物膜方面的效果，LC-EO在食品保鲜中的应用也备受关注。本研究通过实验验证了其在猪肉保鲜中的效果。结果显示，在25°C条件下，LC-EO能够显著延缓猪肉的腐败过程，延长其保质期。对照组（未添加LC-EO）的猪肉在4天内颜色迅速变暗，表面出现大量黏液并伴有刺鼻气味，而添加LC-EO的样品则保持较好的色泽和质地，延缓了腐败的发生。

这一现象可能与柠檬醛对肌红蛋白氧化的抑制作用有关。肌红蛋白是肉类中负责红色颜色的蛋白质，其氧化会导致颜色变暗和风味变差。LC-EO中的柠檬醛可能通过抑制肌红蛋白的氧化，保持猪肉的新鲜度和风味。因此，LC-EO不仅具有抗菌和抗生物膜的作用，还可能在食品保鲜方面发挥重要作用。

### LC-EO对蜡样芽孢杆菌QS系统的干扰

AI-2是AI-2/LuxS群体感应系统中的关键信号分子，其合成与甲硫氨酸代谢密切相关。甲硫氨酸通过转化为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）参与细菌的甲基化反应，而SAM又可以转化为S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）。随后，SAH在酶的催化下生成S-核糖基同型半胱氨酸（SRH），再由LuxS催化生成同型半胱氨酸和AI-2前体4,5-二羟基-2,3-戊二酮（DPD）。DPD通过自身环化重排生成AI-2信号分子，而同型半胱氨酸则重新参与SAM的合成，形成一个循环。

在这一过程中，LC-EO通过抑制关键酶基因（*metC*、*metK*、*metQ*）和下游信号传导基因（*lsrF*、*lsrK*）的表达，干扰了AI-2信号的合成和传递。这不仅影响了蜡样芽孢杆菌的生物膜形成，还可能影响其毒力因子的分泌和群体行为。此外，qRT-PCR结果显示，LC-EO显著抑制了与毒力相关的基因表达，包括*hblA*、*hblC*、*hblD*、*cesB*、*nheA*、*nheB*、*nheC*、*entFM*、*bceT*和*cytK*等，表明其在抑制细菌毒力方面也具有重要作用。

### LC-EO的作用机制总结

综合来看，LC-EO对蜡样芽孢杆菌生物膜的抑制作用主要通过以下机制实现：
1. **干扰群体感应系统**：LC-EO通过抑制AI-2信号分子的合成和传递，阻断细菌的群体感应系统，从而影响其生物膜形成和毒力因子分泌。
2. **抑制运动能力**：LC-EO显著抑制了蜡样芽孢杆菌的游泳、扩散和颤动运动，这可能与其对鞭毛相关基因的抑制作用有关。
3. **减少胞外DNA含量**：LC-EO能够显著降低生物膜中的胞外DNA含量，破坏生物膜的结构稳定性。
4. **影响代谢活动**：LC-EO降低了生物膜中细菌的代谢活性，从而削弱其生存能力和增殖能力。
5. **延缓食品腐败**：LC-EO在猪肉保鲜中的应用表明，其不仅能够抑制蜡样芽孢杆菌的生长，还能延缓肉类的腐败过程，保持其新鲜度和风味。

### 结论与展望

本研究首次系统探讨了LC-EO对蜡样芽孢杆菌生物膜的抑制作用及其机制。结果显示，LC-EO不仅在抗菌方面表现出色，还在抗生物膜方面具有显著效果。其通过干扰AI-2/LuxS群体感应系统、抑制运动能力、减少胞外DNA含量以及影响细菌代谢等多重机制，有效抑制了生物膜的形成。此外，LC-EO在猪肉保鲜中的应用表明，其具有作为天然抗菌剂和食品保鲜材料的潜力。

未来的研究可以进一步探索LC-EO在不同食品基质中的应用效果，以及其与其他天然抗菌剂的协同作用。同时，针对LC-EO的作用靶点和分子机制，可以开展更深入的实验，以期开发更高效的抗菌配方。此外，考虑到LC-EO的天然来源和安全性，其在食品工业中的应用前景广阔，有望成为替代化学防腐剂的环保型保鲜材料。