《Displays》：The model moss
Physcomitrium patens relies heavily on homologous recombination to repair DNA double-strand breaks
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通过敲除 Physcomitrium patens 的 LIG4、POLQ 和 RAD51B 基因，研究其 DNA 双链断裂修复机制。结果显示 RAD51B 基因敲除显著降低辐射抗性并引发严重序列变异，而 LIG4 和 POLQ 敲除影响较小。这表明该 moss 主要依赖同源重组修复 γ 射线诱导的 DSB，HR 途径在损伤修复中起核心作用。
研究团队最近发现，苔藓（*Physcomitrium patens*）细胞具有极强的抗辐射能力，并推测该物种使用一种高效的DNA双链断裂（DSB）修复机制。在修复DSB的过程中，主要涉及三种途径：同源重组（HR）、经典非同源末端连接（c-NHEJ）以及替代末端连接（alt-EJ）。为了确定*P. patens*中具体的DSB修复机制，研究人员对在c-NHEJ、alt-EJ和HR中起关键作用的*LIG4*、*POLQ*和*RAD51B*基因进行了敲除（KO），随后对这些KO植物进行了γ射线照射，并评估其抗辐射能力。
结果显示，野生型（WT）、*lig4*和*polq*植物在抗辐射能力上表现出相似的水平，而*RAD51B*基因敲除的植物则显示出显著降低的抗辐射能力。进一步的实验表明，当同时敲除*RAD51B*和*POLQ*时，植物的抗辐射能力进一步下降，但当同时敲除*RAD51B*和*LIG4*时，其抗辐射能力与单独敲除*RAD51B*的情况类似。此外，在γ射线照射下，植物的干重减少至50%时，WT、*lig4*和*polq*植物主要诱导了单碱基替换，而*RAD51B*和*RAD51B polq*植物则出现了更严重的序列变化，包括大片段的缺失、插入、染色体倒位或易位。这些结果表明，*P. patens*主要依赖HR途径来修复由γ射线引起的DSB，即使在其他修复机制存在的条件下也是如此。
为了进一步确认这一结论，研究人员使用流式细胞术分析了WT和KO植物的细胞周期状态。结果显示，大部分受到照射的细胞处于S/G2期的后期，这表明在HR修复过程中，姐妹染色体可能作为模板发挥作用。这一发现为理解*P. patens*如何利用HR途径进行DSB修复提供了重要线索。
在许多生物体中，HR和c-NHEJ是修复DSB的主要途径。HR在细胞周期的S到G2期特别有效，因为它可以利用姐妹染色体作为同源模板进行精确修复。在HR过程中，DNA末端首先被5′到3′方向切除，形成单链DNA（ssDNA）突起，这些突起随后被复制蛋白A（RPA）复合体迅速覆盖。RAD51是一种具有ATP酶活性的重组酶，它能够将RPA从DNA末端移除，形成核蛋白丝。这些核蛋白丝在DNA中搜索同源序列，并侵入形成置换环。RAD51的同源蛋白，如RAD51B、RAD51C、RAD51D、XRCC2和XRCC3，是与RAD51相似的蛋白组，它们支持RAD51核蛋白丝的形成。这些RAD51同源蛋白可以组装成不同的亚复合体，如BCDX2（RAD51B、RAD51C、RAD51D和XRCC2）或CX3（RAD51C和XRCC3）。其中，RAD51B是BCDX2复合体的一部分，该复合体在ATP水解依赖的情况下促进RAD51丝的成核和生长。
在哺乳动物中，HR在DSB修复中的作用相对较小，而大多数DSB则由c-NHEJ修复。c-NHEJ是一个独立于细胞周期的修复机制，其中Ku70-Ku80异二聚体是第一个与DSB结合的因子。随后，这些异二聚体招募其他c-NHEJ蛋白，如DNA依赖性蛋白激酶催化亚基、X射线修复交叉补足蛋白4（XRCC4）、XRCC4样蛋白和DNA连接酶4（LIG4），以处理、对齐和连接DNA末端。LIG4在c-NHEJ中负责连接单链断裂，这是一个关键步骤。在哺乳动物中，LIG4的破坏会导致胚胎致死。而在拟南芥中，Atlig4突变体虽然可以正常生长并保持生育能力，但表现出对甲基磺酸甲酯（MMS）和电离辐射的高度敏感性。在*P. patens*中，Pplig4突变体显示出对由博来霉素诱导的DNA损伤修复效率降低，并且在紫外B辐射处理下诱导了比野生型更多的突变。
除了HR和c-NHEJ，另一种DSB修复机制——替代末端连接（alt-EJ）也在哺乳动物和植物中存在。alt-EJ依赖于DNA聚合酶θ（POLQ），这是一种低保真度的DNA聚合酶，它利用断裂末端附近的2到20个核苷酸的同源序列进行修复。在小鼠中，POLQ的缺失并不会导致明显的发育异常，但会增加自发和辐射诱导的微核频率。在拟南芥中，缺乏AtPOLQ的tebichi（*teb*）突变体表现出根短、叶片锯齿状和分生等形态缺陷。相比之下，在*P. patens*中，Pppolq突变体可以正常生长，并且对紫外线、甲基磺酸甲酯或顺铂的敏感性没有明显增加。
基于这些观察，研究人员推测*P. patens*可能利用HR、c-NHEJ和alt-EJ三种途径来修复DSB，具体取决于DNA损伤的时间和类型。然而，目前还没有对这些DNA修复缺陷的植物进行相同的DSB诱导处理，因此缺乏定量评估。本研究通过分析γ射线照射下*RAD51B*、*LIG4*和*POLQ*基因敲除的植物，探讨了这三种修复途径在DSB修复中的作用。此外，研究人员还分析了γ射线照射下KO植物在腺嘌呤磷酸核糖转移酶（*APRT*）报告基因中的突变谱。研究结果表明，*P. patens*主要依赖HR途径来修复由γ射线引起的DSB。
为了进一步验证这一结论，研究人员使用了不同的实验方法，包括生长条件的控制、基因敲除的确认以及突变谱的分析。在植物材料方面，研究使用了*P. patens*的Gransden株系作为野生型，并利用已知的*lig4*和*polq*基因敲除株系进行实验。为了维持植物材料，研究人员在BCDAT培养基上培养原丝体组织，并在23°C的连续白光条件下进行培养。在基因敲除方面，研究人员从*P. patens* v6.0注释中获取了基因组序列，并确认了*LIG4*、*POLQ*和*RAD51B*的基因敲除情况。通过这些方法，研究人员能够准确地评估不同基因敲除对DSB修复的影响。
在实验过程中，研究人员发现，当*RAD51B*基因被敲除时，*P. patens*的抗辐射能力显著下降，而*LIG4*和*POLQ*基因的敲除对植物的抗辐射能力几乎没有影响。此外，仅敲除*RAD51B*会导致*APRT*报告基因中出现显著的序列变化，而敲除*LIG4*或*POLQ*则不会产生类似的变化。这些结果进一步支持了*P. patens*主要依赖HR途径来修复DSB的假设。研究还指出，为了更全面地理解*P. patens*如何依赖HR途径进行DSB修复，需要进一步分析其他DSB修复缺陷的植物。
研究团队还提到，在本研究中，他们使用的实验方法和材料得到了相关机构和技术人员的支持。他们特别感谢了在Takasaki Institute for Advanced Quantum Science、National Institutes for Quantum Science and Technology中提供技术帮助的环境压力耐受基因项目、量子应用生物技术项目和照射设施小组的成员。此外，他们也感谢了Nobuko Murakami、Yukiko Sakatsume和Naoko Maeda在实验过程中的技术协助，以及Satoshi Kitamura对文稿的审阅。最后，他们还感谢了Editage（
www.editage.jp）在语言润色方面的帮助。
本研究的发现不仅加深了对*P. patens*如何利用HR途径进行DSB修复的理解，也为探索其他生物体中的DSB修复机制提供了新的视角。苔藓作为模式生物，其独特的基因组结构和修复机制可能为理解更复杂的生物体中的DNA修复过程提供有价值的参考。此外，研究还强调了在基因敲除实验中，选择合适的基因和评估方法对于揭示修复机制的重要性。通过这些实验，研究人员能够更清晰地了解不同修复途径在DSB修复中的作用，并为未来的相关研究奠定了基础。
