Shikonin疗法：通过激活自噬作用并减少真菌负荷来治疗烟曲霉性角膜炎

《Experimental Eye Research》：Shikonin Treats Aspergillus fumigatus Keratitis by Activating Autophagy and Reducing Fungal Load

石蒜素通过激活自噬抑制炎症反应并减少曲霉性角膜炎中真菌负荷，其机制包括降低IL-6、TNF-α和IL-1β水平、促进LC3B-II/I和Beclin-1表达及抑制真菌生长与粘附。

　　

Xuguang Yang|Fan Cong|Lingwen Gu|Qian Wang|Lina Zhang|Jing Lin|Weichen Liu|Xiaofeng Yao|Cui Li|Guiqiu Zhao

中国山东省青岛市青岛大学附属医院眼科

摘要

本研究旨在探讨紫草素（SK）在治疗真菌性角膜炎方面的治疗潜力。研究采用了多种检测方法，包括荧光素钠染色、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、Western blot（WB）、免疫荧光和酶联免疫吸附测定（ELISA）。同时，通过透射电子显微镜（TEM）和吞噬作用测定实验研究了RAW 264.7细胞的自噬和吞噬功能。通过测定最小抑菌浓度（MIC）、结晶紫染色、钙黄绿蛋白染色（CFW）和碘化丙啶吸收试验（PI）以及真菌黏附试验，证实了SK对烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的抑制效果。与接受0.1% DMSO处理的组相比，接受SK处理的组在临床评分以及IL-6、TNF-α和IL-1β水平上均表现出显著下降。SK还促进了自噬蛋白LC3B-II/I和Beclin-1的活性，并降低了P62的水平。SK处理后，RAW 264.7细胞中的自溶体数量增加，同时增强了了对真菌和孢子的吞噬能力。3-甲基腺嘌呤（3-MA）预处理会减弱SK降低炎症标志物的作用。此外，SK还能抑制烟曲霉的生长，破坏细胞膜，削弱生物膜的形成，并抑制孢子的黏附。综上所述，SK通过激活自噬发挥抗炎作用，并通过减少真菌负荷发挥抗真菌作用，显示出治疗真菌性角膜炎的潜在效果。

引言

真菌性角膜炎是一种严重的角膜感染性疾病，在许多发展中国家往往导致不良预后[1]、[2]，可能导致角膜穿孔、视力受损甚至失明[3]、[4]。患者需承担巨大的经济负担，生活质量也会大幅下降[5]、[6]。目前，真菌性角膜炎的治疗主要依靠抗真菌药物，针对相关炎症的治疗手段较少。因此，寻找新的治疗策略至关重要。 紫草是一种传统中药，其药用价值已被认可[7]。药理学研究表明，紫草素是紫草的主要活性成分[8]。由于其显著的药用效果，紫草被广泛用于治疗感染、皮肤疾病、心血管疾病和癌症[9]、[10]、[11]、[12]。近年来，其抗炎作用得到了广泛研究[13]、[14]，但其具体抗炎机制仍有待探讨。研究表明，紫草可通过增强自噬来抑制炎症[15]、[16]、[17]，而在真菌性角膜炎中，自噬具有显著的抗炎效果[18]、[19]、[20]，这表明紫草可能是治疗真菌性角膜炎的有效选择。 此外，已有研究探讨了紫草对细菌和真菌的抑制作用。一项先前的研究显示，紫草通过抑制ATP合成酶来抑制大肠杆菌（E. coli）的生长[21]。此外，紫草还能通过抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生的耐药蛋白、基因和外毒素，降低其毒力[22]。紫草还通过影响白色念珠菌（Candida albicans）和红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）中法尼醇和麦角甾醇的合成，抑制真菌的生长和生物膜的形成[23]、[24]。这些发现表明紫草在真菌性角膜炎治疗中具有潜在的治疗作用。 目前，尚未有关于紫草用于真菌性角膜炎的报道，我们推测紫草对烟曲霉角膜炎具有显著的抗炎和抗真菌效果。我们的研究发现，紫草能够诱导细胞产生自溶体，并增强细胞对菌丝的吞噬作用，从而缓解炎症（通过TEM观察到）。此外，通过孢子黏附试验和吞噬作用试验也证实了紫草在减轻真菌负荷方面的积极作用。基于这些发现，紫草有望成为治疗烟曲霉角膜炎的优秀候选药物。

SK的制备

紫草素（SK，Macklin，中国上海）溶于二甲基亚砜（DMSO，Solarbio，中国北京），配制成浓度为51.2 mM的储备液。进一步将其稀释至0.5、1、2、4、8、16、32和64 μM，用于毒性测试、最小抑菌浓度（MIC）测定、结晶紫染色、碘化丙啶染色（CFW）和真菌黏附试验。感染烟曲霉的小鼠模型接受了32 μM的SK处理，RAW264.7细胞则接受了2 μM的SK处理。

细胞培养和毒性测试

RAW 264.7细胞来源于上海中医药科学院

SK的体内和体外安全性评估

在接种后3天和5天，使用16 μM和32 μM的SK处理后，未观察到角膜荧光素钠染色（图1A）。为了评估SK的毒性并确定后续实验的最佳浓度，进行了CCK-8检测，浓度范围为0.5至64 μM。结果表明，在2 μM以下浓度时，SK不会影响RAW 264.7细胞（图1B）和人角膜内皮细胞（HCECs）的吸光度（图1C）。然而，4 μM浓度的SK显著降低了...

讨论

真菌性角膜炎由真菌感染引起，可能导致视力丧失[3]。机体通过炎症反应试图杀死真菌并减轻感染[32]，但过度激活的炎症反应会损害机体本身[33]，这一现象在真菌性角膜炎中尤为明显[34]。目前用于治疗真菌性角膜炎的药物主要是抗真菌剂，可选方案有限。

结论

综上所述，紫草通过激活自噬、上调LC3B-II/I和Beclin-1的表达以及下调下游炎症因子，从而减轻炎症反应。同时，紫草还能抑制烟曲霉的生长，破坏细胞膜和生物膜，并抑制孢子的黏附能力，从而减少真菌负荷。因此，紫草作为治疗烟曲霉角膜炎的新疗法具有潜力。

CRediT作者贡献声明

Xiaofeng Yao：软件处理、数据管理。 Guiqiu Zhao：数据可视化、项目监督、资金筹措。 Cui Li：资源调配、项目管理、资金筹措。 Qian Wang：项目监督、数据分析。 Lina Zhang：软件处理、数据管理。 Jing Lin：项目监督、数据分析。 Weichen Liu：数据验证。 Xuguang Yang：初稿撰写、方法设计、数据管理、概念构思。 Fan Cong：论文撰写与编辑、项目监督。 Lingwen Gu：项目监督、数据管理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

数据获取

数据可应要求提供。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号81870632、82171029和81800800）和泰山学者计划（编号tsqn202103188）的支持。图形摘要使用BioGDP [49]制作。