低生物量微生物组研究中污染控制与统计效力的定量评估：设计因素与数据特征对结果的影响机制解析

这篇开创性研究通过模拟与真实数据集的系统分析，首次量化揭示了低生物量微生物组研究中的核心规律：组间差异度（beta diversity）和独特菌群数量（unique taxa）是统计结果的主要驱动因素，而污染（contamination）仅对差异丰度分析（DESeq2/ANCOM-BC）的检出数量产生有限影响（假阳性率<15%）。研究强调内部阴性对照（internal negative controls）比公共污染物列表（kitome lists）更能有效控制污染，为争议性无菌环境微生物组研究提供了方法论范式。

　　

ABSTRACT

高通量分子技术的进步使得低生物量环境微生物组研究成为可能，但这类研究面临独特的污染风险挑战。尽管最佳实践指南可减少90%以上的污染，残留污染对统计结果的影响仍缺乏定量评估。本研究通过模拟和真实数据集，系统评估了样本量、菌群数量、组间差异度和污染等因素对微生物组分析的影响。

关键发现

α多样性主要受样本量和群落差异度影响，而与独特菌群数量无关；β多样性则主要由独特菌群数量和组间差异度决定。差异丰度分析中，DESeq2算法在随机分布污染场景下优于ANCOM-BC，但当污染偏向某组时两者表现相当。值得注意的是，污染对加权β多样性影响微弱，但当存在≥10个污染物时会显著改变差异丰度菌的数量——这一发现在7个真实低生物量数据集中得到验证。

IMPORTANCE

研究颠覆了传统认知：低生物量研究中观察到的微生物组差异极少由污染驱动，污染主要影响差异丰度菌的检出数量而非整体结论。通过分析7份公开污染物清单发现，仅18个菌属出现在>50%的清单中，证实依赖公共污染物列表（如包含大肠杆菌Escherichia等临床相关菌属）会导致大量假阴性。研究强烈建议采用实验特异性内部阴性对照，而非保守的污染物过滤策略。

INTRODUCTION

低生物量环境（如胎盘、脑组织、肿瘤）微生物组研究长期面临三大争议：宿主DNA干扰、微生物随机分布（stochastic distribution）和污染影响。其中污染问题最受关注，特别是试剂和环境DNA引入的"kitome"。尽管现有方案能减少90%污染，但过度过滤会剔除真实信号——例如泌尿系统微生物组（urobiome）中常见的链球菌Streptococcus等同时出现在污染物清单中。本研究首次通过量化分析，揭示统计结果真实驱动因素。

RESULTS

▌ 模拟数据生成

采用HeritSeq包构建120组模拟数据集，参数包括样本量（10-240/组）、最大菌群数（10-5000/样本）和组间差异度（sigma2s=0.1-100）。设置随机分布（unweighted）和组间偏态分布（weighted）两类污染场景。

▌ 实验特征的影响

样本量对非加权α多样性（Margalef指数）和加权β多样性（Bray-Curtis）影响有限，但显著改变加权Simpson指数。菌群数量则强烈影响β多样性统计效力——当样本含2000个菌群时，PERMANOVA检验效能提升3.8倍。组间差异度与α多样性P值呈强相关（r=0.82），但仅对ANCOM-BC算法的差异丰度检出数产生影响。

▌ 污染的定量影响

随机污染需达到5个污染物才会引起β多样性P值两倍变化；而差异丰度分析更敏感：DESeq2在4个污染物时即出现2个差异菌的波动。加权污染场景下，DESeq2对<1个污染物就产生响应，但假阳性始终控制在15%以内。深入分析显示，假阳性主要来源于原数据中随机菌群（FDR>0.1）而非污染物本身。

▌ 真实数据验证

688例泌尿系统样本分析显示，污染去除前后β多样性P值变化与模拟数据高度一致（r=0.91）。DESeq2需26个污染物才会引起2个差异菌变化，再现实证研究的稳健性。

DISCUSSION

这项研究为低生物量微生物组研究提供了三大范式转变：

1. 组间差异度和菌群数量是统计结果的主效因素，污染仅次要影响差异丰度菌数量

2. 内部阴性对照比公共污染物列表更可靠，后者可能导致42%临床相关菌属（如肠杆菌Enterobacter）被错误过滤

3. 当检出组间差异时，该结果有85%以上概率反映真实生物学现象

研究同时指出领域现存局限：尚未评估宿主DNA干扰（如线粒体序列mis-annotation）、批次效应等技术偏差的影响。未来需建立更完善的实验-计算联合控制体系，特别是在肿瘤微生物组等争议领域。

MATERIALS AND METHODS

模拟数据采用HeritSeq包的负二项分布模型生成，污染通过rnorm()函数添加随机计数。真实数据来自7项泌尿系统研究（NCBI登录号SAMN42782311-SAMN43012070），使用Decontam包基于内部对照去污。统计采用PERMANOVA（999次置换）和FDR校正，算法比较涵盖DESeq2（Wald检验）和ANCOM-BC（成分线性模型）。所有分析在R 4.2.0完成，可视化通过ggplot2实现。