E3泛素连接酶HECTD4通过调控COX-2抑制肿瘤转移的分子机制研究

本研究通过全基因组CRISPR失活筛选发现未表征的E3泛素连接酶HECTD4作为肿瘤转移抑制因子，其通过降解前列腺素合成酶COX-2（PTGS2）及其调控激酶MKK7，显著抑制乳腺癌细胞锚定非依赖性生长。该发现为COX-2抑制剂预防转移复发提供了理论依据，揭示了HECTD4-COX-2轴在循环肿瘤细胞（CTCs）存活中的关键作用。

　　

Significance

全基因组CRISPR失活筛选首次鉴定出未表征的E3泛素连接酶HECTD4作为肿瘤和转移抑制因子，其核心作用机制是通过降解COX-2实现。研究发现HECTD4缺失导致的促肿瘤和促转移效应完全依赖COX-2的稳定化，这为研究COX-2抑制预防转移复发提供了分子基础。

Abstract

E3泛素连接酶通过调控参与癌症进展的蛋白周转发挥关键作用。为揭示转移能力的调控因子，研究团队利用乳腺癌循环肿瘤细胞（CTCs）进行体内全基因组CRISPR失活筛选，发现HECTD4——一个编码含HECT结构域的泛素转移酶的基因——是强效的肿瘤和转移抑制因子。实验证实纯化的HECTD4在体外介导泛素结合，蛋白质组学结合泛素残留分析鉴定其主要降解靶点为前列腺素合成酶COX-2（PTGS2）。除COX-2外，HECTD4还靶向其调控激酶MKK7。在乳腺癌模型中，HECTD4表达随细胞失去基质粘附而诱导，其缺失会大幅增加COX-2表达，增强锚定非依赖性增殖和肿瘤发生。遗传或药物抑制COX-2可逆转HECTD4缺失细胞的促肿瘤和促转移表型。

Results

CRISPR-i筛选发现HECTD4抑制CTC介导的转移

通过将基因组CRISPR-i文库导入源自晚期激素受体阳性乳腺癌患者的BRx-142 CTC细胞系，在免疫缺陷NSG小鼠中进行3个月体内筛选后，发现7个E3泛素连接酶位列前250个候选基因，其中HECTD4排名第49位。进化树分析显示HECTD4属于含13个成员的HECT亚家族。临床数据显示HECTD4在乳腺癌组织中表达显著降低，且低表达患者无进展生存期更短，尤其在三阴性乳腺癌中表达最低。

HECTD4缺失促进锚定非依赖性增殖和肿瘤发生

在TNBC细胞系MDA-MB-231中，HECTD4敲除使小鼠肿瘤体积增加一倍（457.1 μg vs 204.9 μg）。嵌合肿瘤实验显示HECTD4-KD细胞在原发瘤和转移灶中占比超80%。值得注意的是，这种促肿瘤效应仅在锚定非依赖条件下显现：悬浮培养时HECTD4-KD细胞形成大型球状结构，软琼脂集落形成增加2倍。在MDA-MB-468细胞中也观察到类似表型，尾静脉注射后肺转移灶显著增大。

HECTD4调控COX-2的分子机制

通过CRISPR碱基编辑在HECTD4 N端引入ALFA标签，体外实验证实其具有泛素连接酶活性。双相蛋白质组学分析（全蛋白质组+泛素化肽段富集）鉴定出25个潜在靶标，其中COX-2蛋白水平增加>12倍且泛素化减少>3倍。Western blot显示该调控具有锚定依赖性：在悬浮培养条件下，HECTD4和COX-2表达同步上调，而HECTD4-KD使COX-2蛋白暴增。体外泛素化实验直接证明HECTD4可泛素化HA标记的COX-2。

深入机制研究发现，HECTD4还靶向降解MKK7激酶（MAP2K7）——COX-2转录激活因子c-Jun的上游调控因子。siRNA敲低MKK7可逆转HECTD4-KD引起的COX-2 mRNA升高，但双敲除时COX-2蛋白仍保持高水平，证实HECTD4通过双重机制（直接降解COX-2蛋白+抑制MKK7介导的转录）调控COX-2。

HECTD4-COX-2轴驱动肿瘤发生的功能验证

COX-2敲除或抑制剂Celecoxib处理可完全消除HECTD4-KD细胞的锚定非依赖性增殖优势。关键体内实验显示：在1:1混合移植实验中，COX-2-KD细胞在肿瘤中几乎完全消失，而HECTD4/COX-2双敲除完全逆转了HECTD4单敲的促肿瘤效应。在肺和肝转移灶中，双敲除使HECTD4-KD细胞的生长优势归零，证实其促转移作用完全依赖COX-2。

Discussion

本研究揭示了HECTD4作为新型肿瘤转移抑制因子的双重机制：通过泛素化降解COX-2及其调控激酶MKK7，阻断前列腺素合成通路。特别值得注意的是，该调控网络在锚定非依赖条件下被特异性激活，为循环肿瘤细胞在血流中存活提供了分子解释。与经典炎症介导的促肿瘤机制不同，HECTD4-COX-2轴可能通过维持悬浮细胞的上皮特性（如E-cadherin表达）促进转移定植。这些发现为选择性COX-2抑制剂在预防转移中的应用提供了精准的理论框架，但需权衡心血管副作用风险。未来研究可探索HECTD4表达水平作为COX-2抑制剂疗效预测标志物的可能性。